番木瓜果實(shí)酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建及CpMYB114L互作蛋白的篩選

周陳平，楊 敏，郭金菊，鄺瑞彬，楊 護(hù)，黃炳雄，魏岳榮

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a 果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b 設(shè)施農(nóng)業(yè)研究所，廣東 廣州 510640)

番木瓜(CaricapapayaL.)果實(shí)屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，對(duì)低溫敏感，不適宜冷藏運(yùn)輸，果實(shí)進(jìn)入破色期后會(huì)快速轉(zhuǎn)黃、軟化，進(jìn)而達(dá)到生理成熟并迅速腐爛，嚴(yán)重影響果實(shí)商品品質(zhì)和貨架期，導(dǎo)致30%～60%的果實(shí)失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-4]。因此，開展延緩番木瓜果實(shí)成熟與衰老、延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期的研究，對(duì)促進(jìn)番木瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展、提高其經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義[5]。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的N端含有保守R2R3序列結(jié)構(gòu)域，主要與目標(biāo)基因結(jié)合；C端為非保守序列，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的作用[6]。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物細(xì)胞分化、激素應(yīng)答及次級(jí)代謝物、花青苷和類胡蘿卜素合成等方面起到重要作用，是調(diào)控果實(shí)成熟的重要轉(zhuǎn)錄因子[7-8]。目前在蘋果、香蕉、梨、番茄、桃、葡萄、草莓、柑橘等作物上已開展了關(guān)于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究。在獼猴桃中，AdMYB7通過激活番茄紅素β-環(huán)化酶(LCY-β)的表達(dá)來調(diào)控果實(shí)成熟過程中胡蘿卜素的積累[9]。在番茄中，SlMYB72同時(shí)調(diào)控果實(shí)類胡蘿卜素、葉綠素和類黃酮的代謝[10]。據(jù)Meng等[11]研究報(bào)道，與野生型番茄相比，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子SlAN2的基因過表達(dá)可使轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中乙烯生成量升高、類胡蘿卜素積累增加、果實(shí)軟化加快，從而導(dǎo)致果實(shí)提早成熟。Yao等[12]通過QTL技術(shù)在梨果實(shí)中克隆到與花青苷合成相關(guān)的候選基因PyMYB114，該基因編碼蛋白能夠與PyERF3和PyHLH3互作，共同調(diào)控梨果實(shí)花青苷的合成，表明PyMYB114轉(zhuǎn)錄因子通過乙烯信號(hào)路徑參與調(diào)控梨果實(shí)成熟。然而，蘋果R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MdMYB1調(diào)控果實(shí)成熟的機(jī)理與梨有所不同，當(dāng)蘋果果實(shí)進(jìn)入成熟階段，乙烯響應(yīng)因子MdEIL1能夠直接結(jié)合MdMYB1啟動(dòng)子，激活該基因表達(dá)，正向調(diào)控蘋果著色；同時(shí)，MdMYB1又可通過正向反饋直接調(diào)控乙烯合成相關(guān)基因MdERF3的表達(dá)，促進(jìn)乙烯合成，從而加快蘋果成熟進(jìn)程[13]。上述研究結(jié)果表明，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子可能通過乙烯信號(hào)通路參與調(diào)控果實(shí)成熟，但在不同物種中的調(diào)控路徑存在一定差異。

本研究從前期完成的番木瓜4個(gè)不同成熟期果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組中，選取一個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子，命名為CpMYB114L，通過擴(kuò)增CpMYB114L基因的CDS區(qū)，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-CpMYB114L，利用酵母雙雜交技術(shù)從番木瓜果實(shí)cDNA文庫(kù)中篩選與CpMYB114L互作的蛋白，以期探究CpMYB114L參與調(diào)控番木瓜果實(shí)成熟的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所選育的番木瓜‘GZBG’品種兩性株為研究對(duì)象，于2018年定植，采用常規(guī)栽培技術(shù)進(jìn)行管理，植株生長(zhǎng)狀態(tài)健康良好。參照周陳平等[14]的方法，于2020年9月21日采集表皮無損傷、大小均勻的綠熟期(GS)、破色期(CB)、熟化期(HY)和腐熟期(FY)果實(shí)為試驗(yàn)材料。每個(gè)時(shí)期取樣3個(gè)，取果實(shí)中間部位的果肉10 g，切成小塊，用液氮速凍后貯存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 CpMYB114L基因CDS區(qū)的克隆與分析

前期從番木瓜不同成熟期果實(shí)的轉(zhuǎn)錄組中篩選出一個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)官方網(wǎng)站上進(jìn)行blast比對(duì)后分析其同源性，最終命名為CpMYB114L(NCBI登錄號(hào)：XM_022042529.1)。

果實(shí)樣品在液氮保護(hù)下研磨后，采用Trizol法提取總mRNA，利用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物，中國(guó))反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用軟件Pri-mer Premier 5設(shè)計(jì)CpMYB114L基因CDS區(qū)特異克隆引物，上游引物CpMYB114L-F為5′-ATGGGAGGAGCTGCATGGAC-3′，下游引物CpMYB114L-R為5′-TCACAATGTTCCATTCCACAAATC-3′。以合成的cDNA為基礎(chǔ)模板，用PrimerStar Max DNA Polymerase(Takara，日本)擴(kuò)增該基因的CDS區(qū)，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，回收條帶膠。回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，接種于LB固體培養(yǎng)基，挑選單克隆進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆菌液送至上海生工測(cè)序比對(duì)。用ExPasy(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具預(yù)測(cè)CpMYB-114L蛋白的基本理化性質(zhì)，用MEGA-X軟件對(duì)CpMYB114L蛋白序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3 酵母文庫(kù)的構(gòu)建

按Oligotex mRNA Kits試劑盒(Qiagen，德國(guó))說明書步驟分離純化mRNA，按Supscript double stand cDNA Kit試劑盒(Invitrogen，美國(guó))說明書步驟將純化后的mRNA反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，三框attB1重組接頭與cDNA連接，使用1%瓊脂糖凝膠電泳分離和收集1 000 bp以上的雙鏈cDNA。將雙鏈cDNA與pGADT7載體進(jìn)行all-direct重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)，取轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液10 μL稀釋100倍后，取10 μL涂布于LB平板(含Amp+)上進(jìn)行庫(kù)容量鑒定，庫(kù)容量(CFU/mL)=平板上的克隆數(shù)/10 μL×1 000倍×1×103μL，總庫(kù)容量(CFU)=庫(kù)容量×文庫(kù)菌液總體積(mL)。從平板中隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，分析其插入片段的長(zhǎng)度和重組率。

1.4 誘餌載體pGBKT7-CpMYB114L的構(gòu)建

根據(jù)CpMYB114L基因CDS區(qū)的cDNA序列，分別在其兩端添加SfiⅠ的酶切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物CpMYB114L-S-F為5′-AAGGCCATTACGGCCATGGGAGGAGCTGCATGG-AC-3′，下游引物CpMYB114L-S-R為5′-CCGGCCGAGGCGGCCTCACAATGTTCCATTCCACA-AATC-3′。以pMD19-T-CpMYB114L為模板，擴(kuò)增CpMYB114L基因的cDNA片段，擴(kuò)增方法按TransStart FastPfu DNA Polymerase試劑盒(全式金，中國(guó))說明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物和載體經(jīng)SfiⅠ酶切后，將酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收，利用DNA Ligation Kit(TOYOBO，日本)將克隆連接到pGBKT7載體(上海寶吉生物技術(shù)有限公司)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)上，涂布于LB平板(含Kan+)，隨機(jī)挑選6個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，測(cè)序后進(jìn)行序列比對(duì),驗(yàn)證pGBKT7-CpMYB114L誘餌載體是否構(gòu)建成功。

1.5 誘餌蛋白pGBKT7-CpMYB114L的自激活檢測(cè)

以pGADT7-LARGET/pGBKT7-p53為陽性對(duì)照組、pGADT7-LARGET/pGBKT7-LAMINC為陰性對(duì)照組、pGADT7/pGBKT7-CpMYB114L為自激活檢測(cè)組，分別共轉(zhuǎn)化酵母受體菌AH109。用500 μL 0.1 mol/L LiAc重懸菌體，取5 μL重懸液稀釋40倍，分別涂布于SD/-Trp/-Leu(SD/-TL)缺陷型固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)4 d，從生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選6個(gè)菌落點(diǎn)板于SD/-TL+X-α-Gal和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade(SD/-TLHA)2種缺陷型固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.6 酵母雙雜交文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率的測(cè)定與CpMYB-114L互作蛋白的篩選

用含有正確pGBKT7-CpMYB114L誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，取25 μg酵母雙雜交文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其中，用8 mL無菌水重懸菌體，分別取20 μL重懸液稀釋10，100和1 000倍，將20 μL稀釋液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His(SD/-TLH)+5 mmol/L 3-AT缺陷型固體培養(yǎng)基上，分別標(biāo)記為A、B和C，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，觀測(cè)轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化總數(shù)量(TNT)=(平板A上的克隆數(shù)/20+平板B上的克隆數(shù)/2+平板C上的克隆數(shù)/0.2)×1/3×8 000；轉(zhuǎn)化效率(TE/μg)=TNT/25 μg。用無菌絨布影印清除篩庫(kù)平板背景菌落，繼續(xù)培養(yǎng)7 d；從篩庫(kù)平板中挑取陽性克隆單菌落，轉(zhuǎn)接到SD/-TL固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d；挑選初始轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種至SD/-TL+X-α-Gal和SD/-TLHA缺陷型固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d；挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，送至上海生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI官方網(wǎng)站上進(jìn)行blast比對(duì)，確定互作蛋白的CDS序列區(qū)域。

1.7 互作蛋白的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證及其功能分類

將26種陽性克隆質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化含有正確pGBKT7-CpMYB114L誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子感受態(tài)，以進(jìn)行回轉(zhuǎn)試驗(yàn)，轉(zhuǎn)化方法同1.6節(jié)。通過在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，對(duì)26個(gè)陽性克隆編碼蛋白進(jìn)行功能分類及功能預(yù)測(cè)。

1.8 互作蛋白在番木瓜不同成熟期果實(shí)中的表達(dá)

通過前述試驗(yàn)，篩選到與CpMYB114L互作的4類蛋白，利用前期的番木瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)4類蛋白基因在番木瓜不同成熟期果實(shí)中的表達(dá)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜果實(shí)的總RNA提取與cDNA的合成

提取‘GZBG’4個(gè)不同成熟時(shí)期果實(shí)樣品的總RNA(圖1)，有明顯的28S和18S rRNA條帶，用Oligotex mRNA Kits分離純化得到mRNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈cDNA，用于后續(xù)的CpMYB114L轉(zhuǎn)錄因子CDS區(qū)的克隆和建庫(kù)。

GS.綠熟期；CB.破色期；HY.熟化期；FY.腐熟期

2.2 CpMYB114L基因的克隆與生物信息學(xué)分析

通過分析番木瓜4個(gè)不同成熟時(shí)期果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的轉(zhuǎn)錄因子，選出與果實(shí)成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子CpMYB114L，其表達(dá)量隨果實(shí)成熟逐漸上升，而在腐熟期略有下降(圖2)，這與番木瓜果實(shí)成熟過程中呼吸速率先躍變上升后再下降的變化趨勢(shì)一致。

圖2 CpMYB114L在番木瓜不同成熟期果實(shí)中的表達(dá)量

利用特異引物對(duì)CpMYB114LCDS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果顯示CpMYB114L基因的CDS區(qū)長(zhǎng)度為684 bp(圖3)，編碼227個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為26 304.3，理論等電點(diǎn)為6.23，親水性總平均值為-0.893。

將CpMYB114L基因編碼的蛋白序列輸入擬南芥(https://www.arabidopsis.org/)、番茄(https://solgenomics.net/)、柑橘(https://www.citrusge-nomedb.org/)、蘋果和甜櫻桃(https://www.rosaceae.org/)等物種的信息資源網(wǎng)站及NCBI官方網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，獲得34個(gè)同源基因的蛋白序列。利用MEGA-X軟件對(duì)這35個(gè)蛋白序列進(jìn)行同源性分析，采用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果(圖4)顯示，CpMYB114L轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥、番茄、柑橘等的同源性較遠(yuǎn)，與甜櫻桃(PaWERL)、蒺藜苜蓿(MtMYB1)、黧豆(MpMYB113)、大豆(GmMYB1)和蘋果(MdMYB308L)的同源性較近。

圖4 CpMYB114L編碼蛋白序列的同源性比對(duì)

2.3 番木瓜果實(shí)酵母雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定

將合成的雙鏈cDNA與pGADT7載體進(jìn)行all-direct重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，取10 μL轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌原液稀釋100倍，取10 μL涂布于LB平板(含Amp+)，共獲得230個(gè)克隆，進(jìn)一步計(jì)算可知庫(kù)容量為2.3×106CFU/mL，總庫(kù)容量為1.15×107CFU。從平板中隨機(jī)挑選24個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示，插入片段長(zhǎng)度為750～2 000 bp，無空載，重組率為100%，滿足文庫(kù)要求，可用于文庫(kù)篩選試驗(yàn)。

M.5 000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～24.PCR產(chǎn)物

2.4 誘餌載體pGBKT7-CpMYB114L的構(gòu)建

以pMD19-T-CpMYB114L為模板，用加酶切位點(diǎn)的CpMYB114L-S-F/R引物擴(kuò)增CpMYB114L的CDS區(qū)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物在正確位置。將擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后與pGBKT7載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布于LB平板(含Kan+)過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑選6個(gè)單克隆進(jìn)行PCR菌落擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序比對(duì)，其結(jié)果與CpMYB114L基因CDS序列完全一致(圖6)，說明pGBKT7-CpMYB114L誘餌載體構(gòu)建成功。

M.5 000 DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1～6.PCR產(chǎn)物

2.5 誘餌載體pGBKT7-CpMYB114L的自激活檢測(cè)

圖7表明，pGADT7-LARGET/pGBKT7-p53陽性對(duì)照、pGADT7-LARGET/pGBKT7-LAMINC陰性對(duì)照和pGADT7/pGBKT7-CpMYB114L自激活檢測(cè)組均能在SD/-TL+X-α-Gal缺陷型平板上生長(zhǎng)，而僅有陽性對(duì)照還可在SD/-TLHA缺陷型平板上生長(zhǎng)，pGADT7/pGBKT7-CpMYB114L轉(zhuǎn)化子在2種平板上的生長(zhǎng)狀態(tài)與陰性對(duì)照相同，說明pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活。

pGADT7/pGBKT7-CpMYB114L.自激活檢測(cè)組；pGADT7-LARGET/pGBKT7-p53.陽性對(duì)照；pGADT7-LARGET/pGBKT7-LAMINC.陰性對(duì)照

2.6 pGBKT7-CpMYB114L篩選文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率

將25 μg文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有正確pGBKT7-CpMYB114L誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子感受態(tài)，分別取20 μL重懸液稀釋10，100和1 000倍，取20 μL稀釋液涂布于SD/-TLH+5 mmol/L 3-AT平板上，得到克隆總數(shù)分別為1 336，121和9個(gè)(圖8)，轉(zhuǎn)化總數(shù)量為4.59×105，轉(zhuǎn)化效率為1.83×104/μg，文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率滿足要求，可進(jìn)行下一步互作蛋白的篩選。

圖8 pGBKT7-CpMYB114L篩選文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率

2.7 CpMYB114L互作蛋白的篩選及其回轉(zhuǎn)驗(yàn)證與功能分類

為了消除背景生長(zhǎng)菌落的干擾，在培養(yǎng)到第3天時(shí)，用無菌絨布影印清除篩庫(kù)平板的背景菌，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，從平板中挑取30個(gè)陽性單克隆菌落，轉(zhuǎn)接到SD/-TL+X-α-Gal和SD/-TLHA缺陷型平板中，以pGADT7-LARGET/pGBKT7-p53為陽性對(duì)照、pGADT7-LARGET/pGBKT7-LAMINC為陰性對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)3 d，結(jié)果由圖9可以看出，這30個(gè)初始陽性克隆均能同時(shí)激活HIS3、ADE2和MEL1報(bào)告基因。

1～30.篩選的陽性克隆的編號(hào)；+.陽性對(duì)照；-.陰性對(duì)照

對(duì)30個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序后，除去重復(fù)序列和無法獲得序列的克隆，最終得到26個(gè)序列長(zhǎng)度不同的蛋白編碼基因。將這26個(gè)pGADT7-互作蛋白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化含pGBKT7-CpMYB114L誘餌質(zhì)粒的AH109酵母受體菌以進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示僅24號(hào)陽性克隆在SD/-TL+X-α-Gal平板中不能激活MEL1報(bào)告基因，且在SD/-TLHA平板上生長(zhǎng)較弱，其他25個(gè)陽性克隆均生長(zhǎng)正常。

在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果顯示，這26個(gè)互作陽性克隆編碼蛋白包括?；o酶A硫酯酶13(acyl-coenzyme A thioesterase 13，Acots13)、乙烯響應(yīng)受體1(ethylene response sensor 1，ERS1)、熱休克蛋白42(heat shock protein 42，HSP42)和葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)子159(translocase of chloroplast 159，TOC159) 4類蛋白，其在互作陽性克隆中的占比分別為15.4%，73.1%，7.7%和3.8%(表1)。生物學(xué)功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CpAcots13主要催化?；o酶A水解為游離脂肪酸和輔酶A(CoASH)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)?；o酶A、游離脂肪酸和CoASH的水平；CpERS1(CDS序列全長(zhǎng)為1 914 bp)具有HisKA(位于CDS序列1 036～1 233 bp區(qū)域)和HATPase(位于CDS序列1 372～1 764 bp區(qū)域)激酶結(jié)構(gòu)域，參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控；CpHSP42主要保護(hù)細(xì)胞免受鹽脅迫的損害；CpTOC159參與識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的光合前體蛋白，并將其轉(zhuǎn)入葉綠體。CpAcots13、CpERS1、CpHSP42和CpTOC-159與CpMYB114L互作的CDS序列區(qū)域分別為102～567,859～1 751,304～1 033和615～1 451 bp。

表1 酵母雙雜交文庫(kù)篩選獲得的與CpMYB114L互作的蛋白

2.8 與CpMYB114L互作的候選蛋白基因在番木瓜不同成熟期果實(shí)中的表達(dá)

由圖10中4類蛋白基因在番木瓜不同成熟期果實(shí)中的表達(dá)量分析結(jié)果可以看出，CpHSP42(LOC110815119)在破色期和熟化期果實(shí)中表達(dá)量劇增，而后急速下降；CpERS1(LOC110808109)的表達(dá)量隨果實(shí)成熟先逐漸上升，最后下降，這與CpMYB114L的表達(dá)模式一致；CpAcots13(LOC110819429)的表達(dá)量與果實(shí)成熟呈正相關(guān)；CpTOC159(LOC110821515)的表達(dá)量在破色期劇增后趨于平穩(wěn)。

GS.綠熟期；CB.破色期；HY.熟化期；FY.腐熟期

3 討 論

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子參與眾多的生物過程，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、脅迫響應(yīng)等方面起到重要的調(diào)控作用[15-17]。在有關(guān)R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子互作蛋白篩選的研究中，四季秋海棠BsMYB62基因受低溫和高光強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)，酵母雙雜交篩選出12個(gè)互作蛋白[18]；西瓜中響應(yīng)低溫脅迫的MYB(Cla007586)轉(zhuǎn)錄因子，通過篩選文庫(kù)獲得13個(gè)互作蛋白[19]；花生參與干旱及高鹽脅迫響應(yīng)的基因AhMYB44，在篩選文庫(kù)中與16個(gè)蛋白相互作用[16]。本研究從cDNA文庫(kù)中共篩選出26個(gè)互作陽性克隆，分為4類蛋白，分別包括CpERS1、CpAcots13、CpHSP42和CpTOC159，功能包括乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酰基輔酶A水解、鹽脅迫響應(yīng)和光合相關(guān)前體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。

ERS1是人們最早從模式植物擬南芥中分離出的5個(gè)乙烯受體家族成員之一，根據(jù)受體結(jié)構(gòu)的相似性，ERS1和ETR1屬于亞家族Ⅰ，ETR2、EIN4和ERS2屬于亞家族Ⅱ[20]。ERS1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，具有組氨酸激酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，可以與CTR1結(jié)合，在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到主要作用，是調(diào)控果實(shí)成熟的主要乙烯受體之一[21-23]。當(dāng)利用1-MCP處理果實(shí)后，1-MCP與ERS/ETR乙烯受體結(jié)合，同乙烯競(jìng)爭(zhēng)乙烯受體上的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，阻斷乙烯所誘導(dǎo)的果實(shí)成熟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而延長(zhǎng)果實(shí)貨架期[24-26]。本研究中，CpERS1在番木瓜果實(shí)中的表達(dá)量隨著果實(shí)成熟度上升而逐漸上調(diào)，該結(jié)果與草莓、芒果、梨等果實(shí)ERS1的表達(dá)結(jié)果一致[27-30]。目前對(duì)于乙烯受體的研究主要集中在ETR1基因上，通過對(duì)擬南芥ers1突變體的研究表明，ERS1基因的作用與ETR1相似，但其在乙烯受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的生化機(jī)制及調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明[31]。

有關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子互作蛋白的研究報(bào)道中，MYB轉(zhuǎn)錄因子通常與EILs、ERF等乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游調(diào)控因子互作，共同參與調(diào)控果實(shí)成熟[12-13,32]。本研究結(jié)果表明，CpMYB114L轉(zhuǎn)錄因子與乙烯受體CpERS1的C端(含HisKA和HATPase激酶結(jié)構(gòu)域)互作。因此推測(cè)，CpERS1通過磷酸化CpMYB114L蛋白上的氨基酸使其活化，進(jìn)而啟動(dòng)與果實(shí)成熟相關(guān)的分子調(diào)控反應(yīng)，但這還需通過磷酸化蛋白鑒定試驗(yàn)進(jìn)一步明確。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，初步鑒定MYB與ERS1之間具有關(guān)聯(lián)性。因此，本研究對(duì)進(jìn)一步開展番木瓜果實(shí)CpMYB114L的功能研究及分子調(diào)控機(jī)制，豐富和完善乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因在果實(shí)成熟過程中的作用機(jī)理具有一定的指導(dǎo)意義。