麥洼牦牛干擾素-τ基因的克隆及其表達(dá)分析

高紹帥，唐紫雯，黎 汕，程華琴，殷 實(shí)1a,，李 鍵1a,

(1 西南民族大學(xué) a畜牧獸醫(yī)學(xué)院，b現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

干擾素-τ(IFN-τ)是在反芻動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一種與妊娠相關(guān)的Ⅰ型干擾素，由胚胎滋養(yǎng)層的單核細(xì)胞分泌，其產(chǎn)生無需病毒誘導(dǎo)。IFN-τ是雌性反芻動(dòng)物妊娠的早期信號(hào)，在妊娠識(shí)別過程中起著重要作用[1-2]。IFN-τ與其他Ⅰ型干擾素有相似的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能[3]，如體內(nèi)抗病毒作用[4-5]、抑制癌細(xì)胞增殖作用[6]以及抗炎作用[7-9]。同時(shí)，IFN-τ又與其他Ⅰ型干擾素不同，其細(xì)胞毒性低于細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)產(chǎn)生的其他Ⅰ型干擾素[10-11]。IFN-τ在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受體的介導(dǎo)下，能延長黃體發(fā)揮作用的時(shí)間，從而促進(jìn)黃體發(fā)育及妊娠過程[12]。有研究表明，IFN-τ大量表達(dá)于黃牛等妊娠識(shí)別階段，其不僅對妊娠識(shí)別過程起決定性作用[13]，還在胚胎發(fā)育過程中起重要作用[14]。

卵巢是生殖系統(tǒng)的重要器官，雌性反芻動(dòng)物發(fā)情周期不同階段的卵巢上存在卵泡、紅體、黃體等結(jié)構(gòu)，它們可以分泌各種激素來維持其自身的活動(dòng)以及生殖過程[15-16]。反芻動(dòng)物排卵后，卵泡內(nèi)的細(xì)胞同血管一起向卵泡腔內(nèi)塌陷形成皺襞構(gòu)成紅體，殘留在其內(nèi)的細(xì)胞分化成粒性黃體細(xì)胞和膜性黃體細(xì)胞，繼而形成黃體。黃體主要通過維持體內(nèi)孕激素水平，發(fā)揮維持妊娠和調(diào)節(jié)發(fā)情周期的作用。反芻動(dòng)物繁殖力受多種因素限制，其中黃體發(fā)育成熟及其功能正常與否與動(dòng)物繁殖效率有較大關(guān)系，有研究表明，河南某地3個(gè)肉牛場黃體異常平均發(fā)病率為27.1%，新疆石河子地區(qū)3個(gè)奶牛場黃體異常的平均發(fā)病率為4.9%，由此可見黃體異常對母畜繁殖造成了較大影響[17-18]。IFN-τ可通過不同的方式作用于子宮，延緩黃體溶解，形成抗黃體溶解機(jī)制，這種機(jī)制的失調(diào)可能是導(dǎo)致黃體異常從而影響母畜繁殖力的重要因素[19]。機(jī)體分泌的IFN-τ可以抑制催產(chǎn)素的表達(dá)，繼而通過阻斷前列腺素F2α(PGF2α)脈沖式釋放而阻止黃體退化，維持孕酮(P4)的持續(xù)分泌[20]。已有研究表明，IFN-τ可激活子宮腔上皮細(xì)胞中的JAK/EGFR/ERK/EGR-1信號(hào)通路，從而阻止大部分PGF2α的釋放，有利于胚胎的形成[21]。除此之外，IFN-τ還可通過旁分泌的方式作用于子宮內(nèi)膜，從而誘導(dǎo)黃體中IFN-τ-刺激基因(interferon-τ-stimulated gene,ISG)表達(dá)，阻止卵巢黃體的溶解[22]。IFN-τ還可以通過穩(wěn)定或者上調(diào)子宮內(nèi)膜孕酮受體蛋白的表達(dá)而抑制子宮內(nèi)膜腔的雌性激素受體(ER)和催產(chǎn)素受體(OTR)的轉(zhuǎn)錄，使前列腺素的生成量降低，延緩黃體溶解，使維持妊娠的重要孕激素P4持續(xù)分泌[23-24]。由此可見，IFN-τ能通過多種途徑發(fā)揮抗黃體溶解作用，使黃體持續(xù)分泌孕酮，從而有利于妊娠的維持。

麥洼牦牛(Maiwa Yak)是分布在四川省阿壩藏族自治州紅原縣麥洼、瓦切若爾及蓋縣包座等地區(qū)的特色畜種，是該地區(qū)牧民重要的肉、奶來源和重要的役用畜種，也是其主要經(jīng)濟(jì)來源。然而麥洼牦牛的繁殖力較低，胚胎早期死亡率較高等缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了麥洼牦牛種群數(shù)量的提高和農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)收益[25]。目前，有關(guān)IFN-τ對黃牛等反芻動(dòng)物黃體功能影響的研究較多，但其對麥洼牦牛的影響尚未見報(bào)道。為了探究IFN-τ在麥洼牦牛生長發(fā)育，特別是不同發(fā)情周期卵巢生長發(fā)育中的作用，本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得麥洼牦牛IFN-τ基因序列，并對其進(jìn)行了分析，預(yù)測IFN-τ蛋白序列及功能，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將該基因序列與其他物種進(jìn)行對比分析，同時(shí)檢測麥洼牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、肌肉組織及卵泡期、紅體期、黃體期卵巢組織中的IFN-τmRNA表達(dá)水平，以期為研究IFN-τ基因在麥洼牦牛生長發(fā)育及生殖過程中的作用提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗(yàn)樣本均采自四川廣漢盛大食品有限公司屠宰場。健康麥洼牦牛(3～5歲)宰殺后，立即采集其心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉組織以及處于發(fā)情周期的卵泡期(卵巢表面存在肉眼可見的大卵泡，圖1-A)、紅體期(卵巢中卵泡內(nèi)膜毛細(xì)血管破裂,血液充滿卵泡腔，呈鮮紅色或紫紅色，圖1-B)和黃體期(卵巢中存在明顯的成熟黃體，新鮮時(shí)呈黃色，圖1-C)卵巢。每種組織設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集樣本經(jīng)滅菌生理鹽水沖洗后，再用消毒的外科手術(shù)剪分為約0.5 cm3大小的組織塊，裝入凍存管，進(jìn)行標(biāo)記后置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存。

1.2 主要試劑

膠回收試劑盒(貨號(hào)D2500-01)，為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；Trizol(貨號(hào)15596026)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RR037A)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號(hào)Q711-02)，為南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；PremixTaqTMDNA 聚合酶(貨號(hào)PR1001)，為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker(貨號(hào)B500350)，為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法分別提取麥洼牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、肌肉組織和卵泡期、紅體期、黃體期卵巢組織樣本總RNA。使用核酸分析儀測定RNA濃度、純度。按照Vazyme反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將提取的RNA(A260/A280的值在1.8～2.0)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

參考GenBank中黃牛IFN-τ基因序列(登錄號(hào)HQ235019.1)、內(nèi)參基因GAPDH序列(登錄號(hào)EU195062.1)，通過Primer Premier 5設(shè)計(jì)克隆引物及定量引物(表1)，交由Sangon Biotech公司合成。

表1 本試驗(yàn)所用引物信息

1.5 麥洼牦牛IFN-τ基因的克隆與序列分析

以麥洼牦牛卵巢組織的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增IFN-τ。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：上游引物1 μL，下游引物1 μL，PremixTaqTMDNA 聚合酶12.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將所得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，切取目的片段，按照膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收。將回收純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到載體pMD19-T上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，挑取白色單菌落接種于含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，搖床過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR鑒定，陽性菌液交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

使用DNASTAR 7.1進(jìn)行ORF查找、序列翻譯及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用MegAlign將麥洼牦牛IFN-τ基因序列與大額牛(Bosfrontalis)、山羊(Caprahircus)、黃牛(Bostaurus)、亞洲水牛(Bubalusbubalis)、林麝(Moschusberezovskii)等5種哺乳動(dòng)物的IFN-τ基因序列(登錄號(hào)分別為AY665674.1、DQ154135.1、HQ235019.1、AY665673.1、DQ139308.1)進(jìn)行同源性比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對麥洼牦牛IFN-τ蛋白結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行預(yù)測。使用ExPASY中的SWISS-MODE功能進(jìn)行蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，ProtParam功能進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，用NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0 Server和NetNGlyc 1.0 Server功能分別進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測、N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測。

1.6 IFN-τ在不同組織中的表達(dá)水平

以麥洼牦牛心、肝、脾、肺、腎、小腸、胃、肌肉組織cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR檢測IFN-τmRNA表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以肌肉組織表達(dá)水平為參照，確定IFN-τmRNA在其他樣本中的相對表達(dá)水平。

以麥洼牦牛卵泡期、紅體期、黃體期卵巢組織cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR檢測IFN-τmRNA表達(dá)量，每個(gè)樣本重復(fù)3次。以黃體期卵巢組織的表達(dá)水平為參照，確定IFN-τmRNA在卵泡期、紅體期卵巢組織的相對表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系(20 μL)：上游引物0.4μL，下游引物0.4 μL ，SYBR?Premix ExTaqTMⅡ酶10 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸30 s。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

RT-qPCR結(jié)果采用2-ΔΔCt方法[26]進(jìn)行分析，差異顯著性分析通過SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥洼牦牛IFN-τ基因克隆及同源性分析

PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2)顯示，麥洼牦牛IFN-τ基因克隆目標(biāo)產(chǎn)物條帶長598 bp，與設(shè)計(jì)引物對應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果一致。麥洼牦牛IFN-τ的開放閱讀框(ORF)大小為564 bp，編碼187個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(圖3)。

M.2 000 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.麥洼牦牛IFN-τ基因擴(kuò)增產(chǎn)物

ATG為起始密碼子；TGA為終止密碼子

麥洼牦牛IFN-τ基因序列與大額牛、山羊、黃牛、亞洲水牛、林麝IFN-τ基因的同源性分別為94.00%，90.10%，93.30%，90.60%和85.10%，可見麥洼牦牛IFN-τ基因與大額牛、黃牛的同源性較高。麥洼牦牛IFN-τ基因CDS區(qū)核苷酸有較高的保守性，且麥洼牦牛與黃牛、大額牛的遺傳關(guān)系較近(圖4)。結(jié)果表明，IFN-τ基因在物種進(jìn)化過程中表現(xiàn)出相對保守性，且存在的堿基突變多為同義突變。

圖4 基于IFN-τ基因的麥洼牦牛系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 麥洼牦牛IFN-τ蛋白結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測

麥洼牦牛IFN-τ蛋白分子質(zhì)量為21 124.94 u，分子式為C920H1 455N265O284S11，等電點(diǎn)為5.3，半衰期為30 h，脂肪指數(shù)為87.06，不穩(wěn)定指數(shù)為48.14，平均親水指數(shù)為-0.345。麥洼牦牛IFN-τ蛋白含187個(gè)氨基酸(表 2)，其中Leu、Gly、Gln含量較高，占比分別為15.5%，8.6%和8.0%，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)有17個(gè)；帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為25個(gè)。由此可以推測，麥洼牦牛IFN-τ蛋白整體帶負(fù)電荷，為不穩(wěn)定的親水性蛋白。

表2 麥洼牦牛IFN-τ蛋白氨基酸組成

麥洼牦牛IFN-τ蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成如圖 5所示。從圖5可知，二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比最大的為α-螺旋，參與構(gòu)成α-螺旋的氨基酸有95個(gè)(50.8%)。β-轉(zhuǎn)角、β-折疊及無規(guī)則卷曲的占比依次減少，參與結(jié)構(gòu)形成的氨基酸分別有44個(gè)(23.5%)、32個(gè)(17.1%)及16個(gè)(8.5%)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖略)與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。

圖5 麥洼牦牛 IFN-τ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

磷酸化及糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果表明，麥洼牦牛IFN-τ蛋白共有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，但糖基化位點(diǎn)較少，不存在N-糖基化位點(diǎn)，有1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。麥洼牦牛IFN-τ蛋白共有15個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括絲氨酸磷酸化位點(diǎn)12個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)2個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)最少1個(gè)(圖 6)。

圖6 麥洼牦牛IFN-τ蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

2.3 麥洼牦牛IFN-τ mRNA的組織表達(dá)譜

由圖7可知，IFN-τmRNA廣泛表達(dá)于麥洼牦牛不同組織；IFN-τmRNA在小腸中表達(dá)水平最高，顯著高于其他7種組織(P<0.05)；在肝組織中的表達(dá)水平次之，顯著高于其他6種組織(P<0.05)；其他6種組織表達(dá)水平無顯著差異。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8同

2.4 麥洼牦牛IFN-τ mRNA在不同發(fā)情周期卵巢組織中的表達(dá)

麥洼牦牛IFN-τmRNA在不同發(fā)情周期卵巢組織中的表達(dá)水平見圖8。

圖8 麥洼牦牛IFN-τ mRNA在不同發(fā)情周期卵巢組織中的表達(dá)水平

圖 8表明，IFN-τ mRNA在麥洼牦牛卵泡期卵巢組織中的表達(dá)水平顯著高于紅體期和黃體期卵巢組織(P<0.05)；在紅體期卵巢組織中的表達(dá)水平高于黃體期，但差異不顯著。

3 討 論

IFN-τ是反芻動(dòng)物所特有的一類蛋白質(zhì)，是反芻動(dòng)物妊娠識(shí)別過程中重要的胚源性信號(hào)，在抑制黃體溶解和妊娠過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[27-28]，除此之外，IFN-τ還具有抑制癌細(xì)胞增殖、抗病毒等作用，尤其是其抗病毒作用受到人們的重視，而且有研究表明，即使大劑量使用IFN-τ也無毒副作用，因此，IFN-τ被認(rèn)為是一種新型的具有發(fā)展?jié)摿Φ乃幬颷29]。目前對麥洼牦牛IFN-τ基因的研究較少，關(guān)于麥洼牦牛IFN-τ蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)規(guī)律缺少系統(tǒng)研究。本研究克隆了麥洼牦牛IFN-τ基因,基因序列對比結(jié)果顯示，麥洼牦牛IFN-τ基因序列與大額牛IFN-τ基因序列的同源性最高，除林麝外，與其他物種的IFN-τ基因序列同源性都在90%以上，表明IFN-τ基因在物種進(jìn)化過程中有較高的保守性。麥洼牦牛IFN-τ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，IFN-τ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中占比最大的為α-螺旋，參與構(gòu)成α-螺旋的氨基酸有95個(gè)(50.8%)，說明麥洼牦牛IFN-τ的結(jié)構(gòu)類似于其他Ⅰ型干擾素，基本結(jié)構(gòu)都基于α-螺旋，其中有兩個(gè)區(qū)域之間存在環(huán)狀域間隔，對生物活性區(qū)和受體相互作用的位點(diǎn)具有重要作用[30]。目前對IFN-τ蛋白磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)的報(bào)道較少。本研究對麥洼牦牛IFN-τ蛋白的磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明IFN-τ蛋白有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，但糖基化位點(diǎn)較少，這說明該蛋白可能受到翻譯后修飾的調(diào)控，且復(fù)雜修飾較少。本研究中組織表達(dá)譜結(jié)果表明，IFN-τmRNA廣泛表達(dá)于麥洼牦牛各組織，且小腸中表達(dá)顯著高于其他組織。趙建帥等[31]研究了IFN-γ對家兔十二指腸肌電活動(dòng)的影響，發(fā)現(xiàn)IFN-γ可通過神經(jīng)系統(tǒng)對十二指腸發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。另外，有研究通過建立一種可模擬體內(nèi)腸上皮的體外模型發(fā)現(xiàn)，IFN-λ在抗豬流行性腹瀉病毒及黏膜免疫的抗病毒機(jī)制中發(fā)揮重要作用[32]。但目前對IFN-τ在小腸中的影響未知，本研究結(jié)果可為研究IFN-τ在小腸中的功能提供參考。

本研究結(jié)果表明，IFN-τmRNA在麥洼牦牛卵泡期、紅體期、黃體期卵巢組織中的表達(dá)水平呈下降趨勢，其中卵泡期的表達(dá)量顯著高于紅體期和黃體期，而紅體期與黃體期的表達(dá)水平無顯著差異，提示IFN-τ在發(fā)情早期的卵巢中發(fā)揮重要作用。IFN-τ是反芻動(dòng)物妊娠識(shí)別的信號(hào)，有研究表明胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(ETCs)產(chǎn)生的IFN-τ對奶牛妊娠早期子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞(EECs)表達(dá)牛白細(xì)胞抗原-I(BoLA-I)有一定的影響[33-34]。由此可推測，IFN-τ mRNA在卵泡發(fā)育早期大量表達(dá)，對麥洼牦牛早期胚胎的建立及妊娠早期的識(shí)別具有重要作用。有關(guān)IFN-τ在雌性反芻動(dòng)物卵巢中的功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了麥洼牦牛IFN-τ基因完整序列，其開放閱讀框大小為564 bp，編碼氨基酸187 個(gè)。麥洼牦牛IFN-τ基因CDS區(qū)核苷酸有較高的保守性，且IFN-τ蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白。小腸和肝組織中IFN-τ基因mRNA表達(dá)水平顯著高于其他組織(P<0.05)。在發(fā)情周期不同時(shí)期卵巢中IFN-τ基因mRNA表達(dá)水平也有差異，表現(xiàn)為卵泡期顯著高于紅體期和黃體期。