化學發(fā)光法檢測梅毒螺旋體特異性抗體的價值

黃燕敏 黎曉敏 王襯平 陳加家 劉新成

梅毒是由梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）引發(fā)的性傳播性疾病，該病毒主要是通過人體中的黏膜或者破損的皮膚直接接觸患者感染性病原體進行傳播，持續(xù)時間可長達幾年到幾十年，一旦感染會引起全身性的病變及損害[1]。近年來，我國梅毒的整體患病率呈現(xiàn)上升的態(tài)勢，在經(jīng)濟發(fā)展較好的地區(qū)尤為多見[2]。此外，梅毒還可通過血液的傳播，目前已經(jīng)成為患者手術前常規(guī)檢查的項目。常規(guī)的酶聯(lián)吸附試驗用作初篩，操作時間比較長，不適合臨床應用[3]。血清學診斷是目前梅毒螺旋體診斷的主要方法，檢測血清中的TP抗體成為目前主要的手段，血清學診斷方法主要包括兩種，第一種是非TP抗體血清試驗，檢測方法包括甲苯胺紅不加熱血清試驗（tolulized red unheated serum test，TRUST）、快速血漿反應素環(huán)狀卡片（rapid plasma reagin，RPR）、性病研究實驗室實驗等，主要是對類脂抗原抗體（反應素）進行試驗；第二種是TP抗體血清試驗，檢測方法包括梅毒螺旋體明膠凝集試驗（treponema pallidum particle assay，TPPA）、化學發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、梅毒螺旋體血凝試驗等。CLIA主要是對血清梅毒特異性抗體進行檢測，不僅能夠大大縮短檢測時間，而且靈敏度和特異性顯著提高。基于此，本試驗選取萬江醫(yī)院收治的1 000例術前患者的血清標本采用化學發(fā)光法進行檢測，旨在評價其特異性，結(jié)果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究符合倫理學要求。選取2020年1—12月在萬江醫(yī)院進行常規(guī)術前檢查患者1 000例，其中男性480例，女性520例，年齡1～85歲，平均年齡（45.67±7.42）歲。所有標本采集必須全部為空腹狀態(tài)下抽取患者靜脈血4 mL進行離心，其中離心機轉(zhuǎn)速設置為3 500 r/min，半徑設置為25 cm，離心時間設置為5 min，實施離心反應后，將上層清液取出，置于-20℃冰箱內(nèi)冷藏、待檢。

1.2 檢測方法

儀器與試劑采用全自動免疫自動分析儀（德國西門子ADVIA Centaur XP）、梅毒特異性抗體檢測試劑（德國西門子）進行檢測，質(zhì)控品、定標液均由德國西門子公司提供。具體判斷標準如下：陽性：化學發(fā)光檢測法S/CO值≥1.00，陰性：S/CO值＜1.00[4]。所有陽性標本必須統(tǒng)一采用同一種試劑進行復檢，若經(jīng)復檢后顯示結(jié)果仍為陽性者，則判斷患者為初篩試驗陽性，若檢測結(jié)果為陰性，則不再使用TPPA方法進行補充檢驗，若檢測結(jié)果為S/CO≥1，說明檢測結(jié)果為疑似陽性，則需通過TPAA實施進一步驗證。所有初篩試驗陽性的標本進行附加的TRUST，TRUST試驗中需要的試劑均由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）試劑均由日本富士株式會社提供。根據(jù)實際說明書相關保準通過肉眼判讀結(jié)果，若反應孔4中的孔中央有呈光滑紐扣狀的細胞沉積，說明結(jié)果為陰性，若反應孔4中的孔中央出現(xiàn)不規(guī)則形狀的細胞沉積，說明結(jié)果為陰性。振蕩器、移液器等器材準備齊全備用。

1.3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件，計數(shù)資料以（n，%）描述，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）描述，P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TRUST試驗檢測結(jié)果

醫(yī)院共1 000份血清標本，共初步篩查出46份陽性標本，TRUST試驗檢測結(jié)果顯示陽性的有20份，占43.48%，陰性26份。

2.2 TPPA試驗檢測結(jié)果

46份經(jīng)TPPA試驗復檢后，38份為陽性，占82.61%，8份為陰性，占17.39%，經(jīng)統(tǒng)計學分析特異性為99.82%（95%CI為99.71%～99.85%），陽性預測值為89.45%（95%CI為87.71%～91.75%）。

2.3 CLIA梅毒特異性抗體檢測S/CO值與TRUST、TPPA檢測結(jié)果

S/CO值≥10.00時100%為陽性，在S/CO值＜10.00時，TPPA試驗陽性越來越低，該值與TPPA陽性比例呈正比。此外，S/CO值越低，TPPA陰性比例越高。TRUST試驗中，最高稀釋度為1∶256，TPPA試驗陽性標本中，TRUST試驗陽性18份，陰性20份，隨著S/CO值不斷增加，TRUST滴度≥1∶2逐漸增加；TPPA試驗陰性標本中，TRUST試驗陽性2份，陰性6份。經(jīng)統(tǒng)計學軟件分析，化學發(fā)光法檢測梅毒螺旋體特異性抗體的特異性為99.85%（95%CI為99.86%～99.90%）。見表1。

表1 兩組CLIA陽性標本S/O值TPPA試驗結(jié)果

3 討論

梅毒是經(jīng)典性病中比較為常見的一種，主要由于TP感染所引起，早期可出現(xiàn)硬下疳、低熱，也可能不出現(xiàn)任何癥狀，隨著病情的發(fā)展，出現(xiàn)的臨床癥狀比較多樣和復雜，病情嚴重的患者還可能累及全身各器官，危及患者生命[5]。梅毒的傳播途徑主要是性傳播，血液傳播也較為多見，因此，術前患者在進行手術之前的常規(guī)檢查中包括對術前患者進行梅毒特異性抗體血清標本的檢測。

人體一旦被感染梅毒螺旋體之后，體內(nèi)會產(chǎn)生兩種抗體，一種是患者血清中的反應素，即抗脂質(zhì)抗體，屬于非特異性抗體，另一種是抗密梅毒螺旋體，屬于特異性抗體[6-7]。在傳統(tǒng)檢測中，非特異性梅毒螺旋體抗體方法是常用檢測方法，具有操作簡單、穩(wěn)定性高的特點，但是血中含有抗心磷脂抗體，在較多疾病中均可存在，如高血脂癥、急性病毒性感染、懷孕婦女等，會影響檢測結(jié)果的準確性。目前，采用血清學檢測的方式檢測梅毒特異性抗體是目前臨床上比較常用的方法，試驗方法具有高靈敏度與高特異性對檢測梅毒是至關重要的[8]。CLIA是近年來伴隨著關于梅毒螺旋體的抗原及基因工程研發(fā)成功而建立起來的梅毒特異性抗體的檢測方法，其特點之一就是可檢測細胞的殺菌功能，同時能夠代謝和調(diào)理血清，針對性較強，可有效通過化學發(fā)光底物將傳統(tǒng)顯色底物進行取代，促進發(fā)光信號的增強，使傳統(tǒng)方法中信號持續(xù)時間短的問題得以糾正，促進發(fā)光信號時間的延長，促進其靈敏度的提高[9-10]。CLIA是由美國雅培公司推出的，目前已經(jīng)在國內(nèi)部分實驗室中大量應用，而且每個測試僅需要29 min，靈敏度與特異度均較高，其中敏感度最高能夠得到100%，而且能夠?qū)贵w效價較低的弱陽性血清標本進行檢測，優(yōu)勢顯著。此外，梅毒試劑盒的研發(fā)工藝逐漸成熟，能夠應用于多種梅毒螺旋體特異性蛋白抗原中，制備出固相抗原，對標記抗原進行設定，與樣品中梅毒螺旋體抗體合作形成雙抗體夾心抗體，對其進行洗滌，再加入化學發(fā)光底物液，測定其發(fā)光強度，根據(jù)臨界值判斷梅毒螺旋體特異性抗體的存在情況。但是CLIA作為一種篩查試驗，也會存在一定假陽性，尤其是在梅毒低流行地區(qū)，假陽性的發(fā)生率比較高，因而檢測結(jié)果容易受到影響。

篩查TP感染比較普遍的方法是TRUST，考慮到生物假陽性的現(xiàn)象，需要進行TPPA進行確認。相關研究[11-12]顯示，TPPA試驗具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢，但是由于該試驗操作步驟比較多，過程較為繁瑣，對檢測人員的要求較高，因而進行初篩有一定的困難，而TRUST試驗可取長補短，在一定程度上將初篩進行簡化，且靈敏度與特異性也較強，因此，TRUST試驗是初篩梅毒特異性抗體標本的最佳選擇之一。本研究顯示，采用TRUST試驗對術前患者進行常規(guī)血清抗體檢查，能較為有效地初步篩選出陽性患者。究其原因，TRUST試驗主要以心磷脂作為抗原的非特異性梅毒試驗，主要以心磷脂為靶抗原的抗體有梅毒血清反應素、心磷脂抗體等[13]。因此，TRUST試驗非常適合進行梅毒血清的初步篩選，關鍵還是在于其抗原的非特異性，經(jīng)過該項試驗結(jié)果顯示陽性的患者并不一定是梅毒患者，但是TRUST試驗可以較為準確地篩選出初步判定的陽性者。

有相關研究[14]指出，TPPA試驗是進行梅毒血清抗體特異性復檢的重要手段，雖然該方法操作為純手工，操作流程復雜，對檢測人員具有較高的技術要求，但其相比于TRUST試驗具有更高的特異性及靈敏性，可以較大程度上提升試驗的準確性，非常適合經(jīng)過初步篩選判定為陽性的患者進行進一步檢測篩查。本研究顯示，將初篩的陽性患者再行TPPA試驗，其中又檢測出部分陰性患者，這充分體現(xiàn)了TPPA試驗的臨床應用價值。究其原因，TPPA試驗檢測的是梅毒螺旋體的IgM和IgG的混合抗體，主要是利用已經(jīng)純化的致病性強的抗密梅毒螺旋體，將其中的精制菌體成分包被于明膠顆粒上，因此，精確度比較高[15-16]。

在臨床中進行梅毒血清學檢測診斷時，假陽性一直以來是困擾醫(yī)生的一個重要問題，人們對假陽性的關注度越來越高，TPPA復檢甚至WB確證起到的至關重要的作用就是盡可能的避免或減少假陽性的出現(xiàn)，減少對患者產(chǎn)生的不良影響[17-19]。分析本文中的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示S/O值為6.00時也并不是意味著TPPA試驗的檢測結(jié)果一定是陽性，同理，S/O值為3.00時也并不意味著TPPA試驗的檢測結(jié)果一定是陰性。有相關的報道指出，梅毒特異性抗體S/O值5.073的時候，抗體的特異性對相對達到100%，這就意味著，當S/O值≥5.073時患者不會出現(xiàn)假陽性[20-21]。但是在文章的研究中卻發(fā)現(xiàn)S/O值≥5.073時也出現(xiàn)假陽性的患者，這可能與環(huán)境、地域差別等有一定關系，但是差別是比較微小的。

綜上所述，化學發(fā)光法檢測梅毒螺旋體特異性抗體的特異性較高，TPPA試驗可作為臨床常規(guī)實驗室中梅毒螺旋體特異性抗體篩查試驗的補充試驗。