miR-325-3p通過靶向調(diào)控S100B對(duì)帕金森病模型細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

黃天志 張媚 張細(xì)六 蔡真 (武漢市第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430050)

帕金森病(PD)以黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元缺失為主要病理特征〔1〕。60歲以上人群發(fā)病率大約1%，患病率隨年齡的增加而增長(zhǎng)，PD患病原因未知，目前尚無減緩神經(jīng)退化過程的治療方法〔2〕。研究PD發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為其治療提供分子靶點(diǎn)，是該疾病目前研究的重點(diǎn)。

研究表明，miRNA參與包括PD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，miRNA可能是PD的診斷標(biāo)志物，靶向特定的miRNA也可作為PD的潛在靶向治療策略〔3〕。miR-325-3p在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜〔4〕和心肌梗死大鼠的心肌組織〔5〕中均表達(dá)下調(diào)，通過不同方式上調(diào)miR-325-3p可對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜起保護(hù)作用，減弱心肌組織的損傷程度。而本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，S100B可能是miR-325-3p的靶基因。S100在阿爾茨海默病(AD)患者血清中含量顯著升高，與AD患者認(rèn)知損傷程度相關(guān)〔6〕。S100B很可能是參加PD發(fā)生發(fā)展的重要蛋白，抑制其過表達(dá)有可能為臨床PD的治療提供新的研究思路和方向〔7〕。兩者在PD模型細(xì)胞中的作用和關(guān)系尚不清楚。本研究通過以不同濃度的1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MPP+)處理SK-N-SH細(xì)胞24 h的方式建立PD細(xì)胞模型，以上調(diào)miR-325-3p和下調(diào)S100B表達(dá)的方法來檢測(cè)兩者對(duì)PD模型細(xì)胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料 SK-N-SH(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤)細(xì)胞購自ATCC；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國(guó)Gibco公司，MPP+、胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；S100B抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體和活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3抗體和抗GAPDH抗體購自英國(guó)Abcam公司；總RNA提取試劑盒、 real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Invitrogen公司；丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)BD公司；引物、miR-325-3p模擬物(miR-325-3p)、miR-325-3p抑制劑(anti-miR-325-3p)、S100B干擾劑(si-S100B)、S100B過表達(dá)載體(pcDNA-S100B)、陰性對(duì)照(miR-NC、si-NC、anti-miR-NC和pcDNA)、S100B的野生型和突變型雙熒光素酶載體購自上海吉瑪基因；流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司，光學(xué)顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購自美國(guó)Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將SK-N-SH細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中(含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)，于飽和濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2PD細(xì)胞模型建立〔7〕取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH細(xì)胞進(jìn)行模型建立。分為Con組：SK-N-SH細(xì)胞正常培養(yǎng)；MPP+組：培養(yǎng)液中加入終濃度為100 μmol/L的MPP+，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MPP++轉(zhuǎn)染組：加入終濃度為100 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將加入MPP+后培養(yǎng)24 h的SK-N-SH細(xì)胞，稀釋為1×106個(gè)細(xì)胞/ml，以每孔200 μl(1×105個(gè)/孔)接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：miR-325-3p過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-325-3p)，S100B抑制組(轉(zhuǎn)染si-NC和si-S100B)，miR-325-3p抑制組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和anti-miR-325-3p)，miR-325-3p和S100B過表達(dá)組(轉(zhuǎn)染miR-325-3p+pcDNA和miR-325-3p+pcDNA-S100B)，S100B野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(轉(zhuǎn)染miR-NC+WT-S100B、miR-325-3p+WT-S100B、miR-NC+MUT-S100B和miR-325-3p+MUT-S100B)，將各載體或片段轉(zhuǎn)入MPP+誘導(dǎo)24 h的SK-N-SH細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h，驗(yàn)證無誤進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4Real-time PCR檢測(cè)RNA的表達(dá) 收集MPP+誘導(dǎo)和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板按照 real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)合成S100B mRNA和miR-325-3p，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；94℃30 s、59℃ 45 s、72℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5分光光度法檢測(cè)細(xì)胞中MDA和GSH-Px的含量 收集MPP+誘導(dǎo)和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，冰浴破碎細(xì)胞，離心后取上清，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算MDA和GSH-Px含量。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集MPP+誘導(dǎo)和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，按照膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)試劑盒說明書進(jìn)行操作，先加 200 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl PI，混勻，室溫避光孵育15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集MPP+誘導(dǎo)和(或)轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，冰浴超聲破碎細(xì)胞，離心收集蛋白，將蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗S100B(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶4 000)、Bax抗體(1∶3 000)、cleaved-caspase3抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)，4℃過夜孵育，含0.05% Tween20的中性洗滌緩沖液(PBST)洗膜2次，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h，顯影，以GAPDH為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-325-3p和S100B在MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷中的表達(dá) 100 μmol/L的MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞可達(dá)到最好的效果，實(shí)驗(yàn)均采用100 μmol/L MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞(PD細(xì)胞)模型。結(jié)果顯示，與Con組相比，MPP+組誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞中S100B mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.05)，miR-325-3p表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)S100B蛋白表達(dá)

表1 miR-325-3p和S100B在MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷中的表達(dá)

2.2miR-325-3p過表達(dá)可減輕MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞氧化損傷及凋亡 與Con組相比，MPP+組SK-N-SH細(xì)胞中miR-325-3p表達(dá)、GSH-Px含量、Bcl-2表達(dá)顯著下降，MDA含量、Bax、cleaved-caspase3蛋白表達(dá)、凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-325-3p組細(xì)胞中miR-325-3p表達(dá)、GSH-Px含量、Bcl-2表達(dá)顯著升高，MDA含量、Bax、cleaved-caspase3表達(dá)、凋亡率顯著降低(均P<0.05)，見表2、圖2、圖3。

1～4：Con組、MPP+組、MPP++miR-NC組、MPP++miR-325-3p組圖2 Western印跡檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖3 miR-325-3p過表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞凋亡的影響

表2 miR-325-3p過表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞氧化損傷及凋亡的影響

2.3干擾S100B表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的影響 與Con 組相比，MPP+組SK-N-SH細(xì)胞的S100B蛋白表達(dá)、MDA含量和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，GSH-Px含量和Bcl-2表達(dá)顯著下降，細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)；與MPP++si-NC組相比，MPP++si-S100B組S100B蛋白表達(dá)、MDA含量和Bax蛋白表達(dá)顯著降低，GSH-Px含量和Bcl-2表達(dá)顯著上升，細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)，見表3、圖4。

表3 干擾S100B表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的影響

1～4：Con組、MPP+組、MPP++si-NC組、MPP++si-S100B組圖4 Western印跡檢測(cè)S100B和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4miR-325-3p靶向調(diào)控S100B的表達(dá) Targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，S100B的3′UTR中含有與miR-325-3p互補(bǔ)的序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，過表達(dá)miR-325-3p組野生型WT-S100B的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性顯著下降(P<0.05)；而突變型MUT-S100B的熒光素酶相對(duì)活性無顯著變化，見表4。Western印跡結(jié)果表明，與miR-NC組(0.40±0.04)相比，過表達(dá)miR-325-3p可使S100B表達(dá)量顯著下降(0.23±0.02，P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.38±0.04)相比，抑制miR-325-3p表達(dá)可上調(diào)S100B表達(dá)量(0.83±0.08，P<0.05)，見圖6。

圖5 S100B的3′UTR中含有與miR-325-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖6 Western印跡檢測(cè)S100B蛋白表達(dá)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5S100B過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-325-3p過表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的作用 與MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-325-3p組的SK-N-SH細(xì)胞中S100B蛋白表達(dá)、MDA含量和Bax蛋白表達(dá)顯著下降，GSH-Px含量和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與MPP++miR-325-3p+pcDNA組相比，MPP++ miR-325-3p+pcDNA-S100B組SK-N-SH細(xì)胞中S100B蛋白表達(dá)、MDA含量和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，GSH-Px含量和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)，見圖7、表5。

1～4：MPP++miR-NC組、MPP++miR-325-3p組、MPP++miR-325-3p+pcDNA組、MPP++miR-325-3p+pcDNA-S100B組圖7 Western印跡檢測(cè)S100B和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 S100B過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-325-3p過表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SK-N-SH細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

miRNA參與PD的發(fā)病機(jī)制，幾乎所有與PD相關(guān)的基因都是由miRNA調(diào)控的，血清和腦脊液來源外泌體中穩(wěn)定存在的miRNA也使其可能成為PD的可靠診斷工具，調(diào)節(jié)miRNA的水平可能是PD靶向治療的新策略〔8〕。S100B是由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞具有旁分泌和自分泌作用，S100B根據(jù)其濃度發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)或毒性作用，低濃度下(nmol濃度)S100B刺激軸突的生長(zhǎng)，提高神經(jīng)元在發(fā)育過程中的存活率；細(xì)胞外高濃度(μmol濃度)S100B在體外刺激促炎細(xì)胞因子的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而在腦損傷、缺血、神經(jīng)退行性、炎癥和精神疾病中S100B均會(huì)增加〔9〕。S100B在PD患者腦脊液中水平升高，在PD死亡患者的黑質(zhì)中表達(dá)上調(diào)，體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)也表明，S100B的消融導(dǎo)致神經(jīng)保護(hù)、微膠質(zhì)增生和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)降低〔10〕。夜間S100B和早晨S100B的變化與PD的嚴(yán)重程度和睡眠中斷有關(guān)，S100B被認(rèn)為是PD患者睡眠相關(guān)神經(jīng)炎癥的生物標(biāo)志物〔11〕。S100B基因3′-非編碼區(qū)(UTR)的一個(gè)功能性單核苷酸多態(tài)性rs9722，與PD發(fā)病年齡密切相關(guān)〔12〕。本研究與上述研究結(jié)果類似〔10〕。以上研究結(jié)果均表明，靶向S100B可能是PD的潛在治療策略。

本研究通過TargetScan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，S100B 的3′-UTR中含有與miR-325-3p互補(bǔ)的序列，S100B可能是miR-325-3p的靶基因。在低氧缺血性腦損傷(HIBD)中，miR-325-3p是松果體芳烷基胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Aanat)的靶基因，miR-325-3p上調(diào)可抑制新生大鼠HIBD后Aanat的表達(dá)，減輕HIBD的損害〔13〕。在大鼠垂體前葉細(xì)胞中，尿質(zhì)皮素(UCN)2可促進(jìn)miR-325-3p的表達(dá)，并參與應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠垂體促黃體生成素(LH)分泌抑制〔14〕。在脊髓損傷(SCI)中，miR-325-3p通過抑制表皮生長(zhǎng)因子受體/絲裂原活化蛋白激酶(EGFR/MAPK)信號(hào)通路，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，釋放炎癥因子，減輕SCI后繼發(fā)性損傷，提示miR-325-3p可以作為SCI的治療靶點(diǎn)〔15〕。說明miR-325-3p參與腦和脊髓等神經(jīng)功能過程，但其在PD中尚未被研究。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-325-3p在MPP+誘導(dǎo)的SK-N-SH細(xì)胞(PD模型)中表達(dá)顯著下降，過表達(dá)miR-325-3p減輕MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡。通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western印跡發(fā)現(xiàn)，miR-325-3p靶向負(fù)調(diào)控S100B的表達(dá)，過表達(dá)S100B則會(huì)逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-325-3p對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PD模型細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響作用，證實(shí)了在PD模型細(xì)胞中miR-325-3p與S100B之間具有調(diào)控關(guān)系。

綜上，PD細(xì)胞模型中miR-325-3p通過靶向抑制S100B的表達(dá)，減輕PD模型細(xì)胞氧化損傷，抑制細(xì)胞凋亡。說明miR-325-3p和S100B是PD的潛在分子靶點(diǎn)，對(duì)PD的治療和診斷具有重要的指導(dǎo)作用。