糖腎灌腸方在大鼠糖尿病腎病JAK/STAT信號通路內(nèi)的作用

李晶 馮濤 陳晨 葉婷 馮程程 李惠 馬麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 1內(nèi)分泌科，新疆 烏魯木齊 830000；2普外二科)

糖尿病腎病(DN)是由糖尿病引起的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，早期表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率增高，同時(shí)有尿蛋白出現(xiàn)，最后會(huì)發(fā)展成終末期腎臟病(ESRD)〔1〕。當(dāng)病情發(fā)展為腎衰竭，會(huì)給患者及家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)可誘導(dǎo)引發(fā)各類心血管疾病〔2～4〕。隨著生活水平的提高和生活方式的改變，人口老齡化現(xiàn)象不斷加重，DN已從一種罕見病發(fā)展為流行疾病，患病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢〔5〕。全球范圍內(nèi)，糖尿病和慢性腎臟疾病(CKD)已經(jīng)成為有待解決的公共衛(wèi)生問題，其中DN又是CKD首要病因〔6〕。DN由于耗氣傷陰，病情遷延，陰損及陽，漸致痰、郁、濕、熱等病理產(chǎn)物瘀阻血脈，津血交換受阻，廢物積聚日久成毒，毒(糖毒、脂毒)隨邪生入絡(luò)，伏藏不去，危及生命〔7〕。

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科中藥灌腸制劑：糖腎灌腸方可應(yīng)用于DKD各臨床分期，改善患者臨床癥狀，提高生活質(zhì)量，同時(shí)延緩DN的進(jìn)程，可干預(yù)DN微量蛋白尿期向臨床蛋白尿期進(jìn)展。糖腎灌腸方可降低DN患者血同型半胱氨酸及內(nèi)皮素的水平〔8〕。該方通過腸道途徑治療DN，還可降低尿蛋白、尿素、肌酐等毒素水平，同時(shí)在調(diào)節(jié)血糖、血壓，改善患者臨床癥狀等方面有一定療效〔9〕。Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)信號通路的激活可促使腎小球系膜細(xì)胞增殖，腎組織纖維化，最終導(dǎo)致DN的形成〔10～12〕。本研究探討糖腎灌腸方在DN JAK/STAT信號通絡(luò)內(nèi)的作用。

1 材料和方法

1.1材料 SD大鼠60只，2月齡；體重200～250 g；由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物批號：XJ-LJ-20190811)。TIANScript RT Kit 、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)購自中國天根公司；大鼠醛固酮(ALD)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自中國Elabscience公司；大鼠纖維連接蛋白(FN)ELISA試劑盒、大鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1 ELISA試劑盒均購自美國Cusasbio公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。隨機(jī)分為5組，每組12只：對照組(A組)、DN模型組(B組)、糖腎灌腸方組(C組)、纈沙坦組(D組)，糖腎灌腸方+纈沙坦給藥組(E組)。

1.2.2DN動(dòng)物模型 采用 STZ 合并單側(cè)腎切除與高脂高糖飲食的DN模型建立〔13〕。各組大鼠用代謝籠收集24 h尿液，測定尿量>原尿量50%、尿蛋白排泄率>30 mg/24 h 視為DN模型制備成功。

1.2.3藥物干預(yù) A組：生理鹽水2 ml； B組：生理鹽水2 ml；C組：從第8周開始灌腸給予0.13 ml/10 g糖腎灌腸方溶液；D組：給予纈沙坦片溶液灌胃0.12 mg/10g；E組：灌腸給予 0.13 ml/10 g糖腎灌腸方溶液，并灌胃給予 0.12 mg/10 g纈沙坦溶液。每日上午灌腸給藥1次，灌腸周期為4 w，給藥期間給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和高壓滅菌水。

1.2.4ELISA 收集大鼠血漿，按照ELISA試劑盒說明書檢測FN、TGF-β1的表達(dá)水平

1.2.524 h尿量、尿蛋白、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)測定 尿微量白蛋白的測定：在實(shí)驗(yàn)灌腸治療4 w后，用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，測定大鼠24 h尿蛋白；用自動(dòng)生化分析儀分別測定各組大鼠BUN、Cr。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 通過軟件設(shè)計(jì)JAK2、STAT1、STAT3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物。按照Trizol法提取RNA，并通過加入PrimeScript Buffer、RT Enzyme Mix I、Oligo(dT)15(15 μmol/L)、Random 6 mers(100 μmol/L)、RNA和RNase Free dH2O，37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA。然后按照qRT-PCR試劑盒反應(yīng)步驟：分別加入正向引物、反向引物、2×SYBR Select Master Mix 、RNase Free dH2O和cDNA，95℃，10 min，95℃，15 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃，15 s。qRT-PCR算法(相對定量，2-ΔΔCt法)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ELISA檢測血漿中FN、TGF-β1水平 A組FN、TGF-β1水平顯著低于其他各組(P<0.05)；B組FN、TGF-β1水平顯著高于其他各組(P<0.05)；E組FN、TGF-β1水平顯著低于C組和D組(P<0.05)。見表1。

表1 各組血漿中FN、TGF-β1水平一般指標(biāo)水平比較

2.2各組指標(biāo)水平比較 A組尿量、尿微量蛋白、BUN、Cr水平顯著低于其他各組(P<0.05)；B組尿量、尿微量蛋白、BUN、Cr水平顯著高于其他各組(P<0.05)；E組尿量、尿微量蛋白、BUN、Cr水平顯著低于C組和D組(P<0.05)。見表1。

2.3各組JAK2、STAT1、STAT3 mRNA水平比較 A組JAK2、STAT1、STAT3水平顯著低于其他各組(P<0.05)；B組JAK2、STAT1、STAT3水平顯著高于其他各組(P<0.05)；E組JAK2、STAT1、STAT3水平顯著低于C組和D組(P<0.05)。見表2。

表2 各組腎臟組織中JAK2、STAT1、STAT3水平比較

3 討 論

引起DN的發(fā)病因素是多方面且復(fù)雜的。JAK-STAT信號通路可被大多數(shù)細(xì)胞因子刺激激活，與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、分化等生物學(xué)功能密切相關(guān)〔17,18〕。JAK2、STAT1和STAT3是該信號通路的主要作用分子。在高糖環(huán)境下會(huì)激活JAK/STAT信號通路，從而導(dǎo)致STAT1、STAT3在DN大鼠體內(nèi)表達(dá)量升高，又可誘導(dǎo)TGF-β1的大量表達(dá)，刺激FN表達(dá)上升，從而誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增生肥大和刺激系膜基質(zhì)增多，最終可導(dǎo)致 DN〔19〕。本研究通過糖腎灌腸方、纈沙坦和糖腎灌腸方+纈沙坦聯(lián)合用藥，對DN大鼠進(jìn)行藥物干預(yù)發(fā)現(xiàn)腎灌腸方、纈沙坦單獨(dú)用藥無明顯差異，都可較為明顯降低JAK2、STAT1、STAT3、TGF-β1和FN的表達(dá)。但兩者聯(lián)合用藥效果更為明顯，可顯著降低尿量、尿蛋白、尿素、肌酐等毒素水平，對JAK/STAT信號通路內(nèi)的因子有顯著的抑制作用。

綜上，糖腎灌腸方在DN中的機(jī)制可能為中藥灌腸通過改善腸道生態(tài)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)JAK/STAT信號通路，延緩DN進(jìn)展。