大鼠脊髓損傷致痙攣后五羥色胺1D受體的表達

孟鑫 張向 張超 田煥娜 許倩 魏煒 任立群

(承德醫(yī)學院河北省神經(jīng)損傷與修復重點實驗室，河北 承德 067000)

痙攣是脊髓損傷(SCI)后的一種常見并發(fā)癥，是以速度依賴的緊張性牽張反射(肌張力)增強伴腱反射亢進為特征的運動功能障礙〔1〕。痙攣會引發(fā)許多問題，嚴重或長期痙攣時，會出現(xiàn)肌肉纖維化、疼痛、關節(jié)僵硬、甚至攣縮等，影響患者的功能恢復和生活質量，加重護理負擔，是亟待解決的醫(yī)學難題〔2〕。

痙攣的機制十分復雜，尚不明確，5-羥色胺(HT)及其受體數(shù)量和活性的改變，會導致不同程度的運動功能障礙，對SCI后痙攣的發(fā)病機制有重要作用〔3〕。有研究表明，脊髓中5-HT等神經(jīng)傳遞對感覺、運動和自主功能的調節(jié)至關重要，并通過激活其受體產生不同的生理功能〔4，5〕。5-HT受體主要包括5-HT1-5-HT7受體家族，5-羥色胺1D受體(HT1DR)是5-HT1受體家族中受體亞型，并有研究表明，5-HT1DR是γ運動神經(jīng)元的標志物，能夠在正在脊髓運動回路中對準確接收和傳遞感覺信息起重要作用〔6,7〕。但SCI后，5-HT1DR的變化與5-HT1DR如何介導脊髓運動和感覺功能、是否與痙攣相關尚不明確。本研究旨在揭示5-HT1DR在SCI致痙攣后的變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 36只SPF級Wistar雄性大鼠，體質量(200±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔SCXK(京)2016-0011〕。于承德醫(yī)學院實驗動物中心〔SCXK(冀)2017-001〕適應性飼養(yǎng)1 w后，將大鼠隨機分為Sham組18只和SCI組18只，每組隨機再分為3個亞組各6只，分別用于免疫熒光染色、Western印跡和實時熒光定量PCR實驗。

1.2主要試劑 β-Actin小鼠單克隆抗體(cell signaling technology，美國)，5-HT1DR小鼠單克隆抗體(又名SR-1D抗體，Santa Cruz，美國)，Alexa Fluor 594 標記驢抗小鼠IgG(Invitrogen，美國)，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(中杉金橋，中國)，4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Abcam，英國)，RNA 提取試劑盒、cDNA和PCR擴增試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.3動物模型制備 大鼠脊髓S2全橫斷SCI組模型制備方法是依據(jù)Lucas-Osma等〔8〕和Bennett等〔9,10〕廣泛應用的造膜方法進行，具體如下：通過持續(xù)吸入異氟烷(2.0%～2.5%)麻醉大鼠，全身麻醉后俯臥位固定大鼠、無菌條件下操作，定位于L2椎體(L2椎體對應脊髓S2節(jié)段)，打開皮膚層及皮下組織層，于手術顯微鏡下操作，使用手術刀片分離棘突兩側肌肉，暴露L2椎體的棘突，咬骨鉗咬除L2椎體，暴露S2節(jié)段脊髓，顯微解剖鑷剝離脊髓硬脊膜并局部應用0.1～0.3 ml的利多卡因(1%)，隨后剝離脊髓蛛網(wǎng)膜，使用負壓吸引器將脊髓吸出，橫截面完全離斷1～3 mm，注意要在手術解剖顯微鏡下仔細觀察確保脊髓被完全橫斷，應避免損傷脊髓背部血管，最后逐層縫合肌肉層和皮膚層。Sham組：使用咬骨鉗僅去除L2椎板，確保脊髓硬脊膜無損傷，再逐層縫合肌肉層和皮膚層。

1.4術后護理 脊髓S2全橫斷損傷后，大鼠尾部的感覺和運動功能障礙，注意鼠籠內墊料每天更換，保持鼠籠內干燥清潔，防止大鼠尾部壓力性潰瘍和自嗜等情況發(fā)生。

1.5脊髓損傷后60 d尾部痙攣評分 術后60 d，使用Bennett等〔9,10〕鼠尾痙攣評分法進行大鼠尾部痙攣評分，通過雙盲法進行檢測，具體操作：使用大鼠固定器固定大鼠身體，尾部暴露在外，自然懸空；左手輕握大鼠尾根，右手使用生理鹽水浸過的濕紗布緊貼大鼠尾部從尾根到尾尖方向下滑，當右手從大鼠尾端劃落，左手立即松開尾巴，重復以上完整動作刮擦3～4次，刮擦后大鼠尾部在大鼠固定器外可自由活動并懸空，此時需觀察大鼠尾部運動并根據(jù)Bennett等〔9,10〕鼠尾痙攣評分0～5分的標準記錄評分，結束后將大鼠取出放入墊料籠。

1.6免疫熒光染色檢測5-HT1DR的表達 術后60 d，使用4%水合氯醛進行大鼠麻醉，以0.9%的生理鹽水和4%的多聚甲醛進行灌注。在解剖顯微鏡下，觀察在S2節(jié)段脊髓是否被完全橫斷，確定脊髓被完全橫斷即造膜成功，提取脊髓S2節(jié)段以下，用4%多聚甲醛后固定24 h，導入30%蔗糖24～48 h，使用滑動式冰凍切片機將脊髓連續(xù)橫切為40 μm薄片。依次將10張切片放置于24孔細胞培養(yǎng)板一個孔中，如未及時處理將組織放入防凍液中并保存于-20℃冰箱中。每組從每孔中隨機抽取一張完整切片，一組依次選12～13片用于免疫熒光染色〔11〕。

免疫熒光染色檢測5-HT1DR：使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)液體漂洗10 min；加入PBS-T(PBS液體中加入0.1%Triton)液體漂洗10 min；加入含5%驢血清的PBS-T室溫封閉1 h；PBS-T液體漂洗10 min；分別加入小鼠源抗5-HT1DR(1∶100)，4℃孵育過夜。第2天PBS-T清洗4次，每次15 min；后續(xù)實驗進行避光操作，Alexa Fluor 594 標記的驢抗小鼠(1∶200)孵育1 h，PBS清洗；滴加DAPI室溫孵育5 min，PBS清洗后常規(guī)免疫熒光封片；陰性對照檢測：組織直接在4℃孵育過夜不添加5-HT1DR抗體，其余實驗步驟不變。使用熒光顯微鏡對所有切片觀察，并拍攝圖像。使用ImageJ軟件，對選定脊髓灰質的DH、IMZ和VH三個區(qū)域，進行5-HT1DR免疫反應陽性光密度值的定量分析。

1.7Western印跡檢測脊髓組織中5-HT1DR的表達 術后60 d，采用4%水合氯醛麻醉，提取脊髓損傷段S2以下新鮮組織放于0.9%生理鹽水培養(yǎng)皿(放于冰上)中，去除多余的神經(jīng)根和血液。制備脊髓組織樣品蛋白，二喹啉甲酸(BCA)定量后儲存?zhèn)溆谩Ｖ颇z、上樣、電泳、轉模、5%脫脂奶粉封閉過夜；β-actin 抗體(1∶1 000)，5-HT1DR 抗體(1∶200)室溫孵育，3 h；山羊抗小鼠IgG(1∶3 000)室溫孵育，1 h；電化學發(fā)光(ECL)法顯色成像。Image J軟件分析并計算出各組蛋白相對表達量。

1.8實時熒光定量PCR檢測脊髓組織中5-HT1DR的表達 術后60 d，取新鮮脊髓S2節(jié)段以下，按照TaKaRa試劑盒說明書進行總RNA提取、反轉錄cDNA和RT-PCR儀進行PCR擴增，檢測脊髓組織中5-HT1DR的mRNA表達水平。選取β-actin作為內參，所有引物設計由TaKaRa公司提供，引物序列：β-actin：正向引物GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA；反向引物GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG，150 bp；5-HT1DR：正向引物GCTGCCAAACCAGTCCCTAGAA，反向引物AATGATGGATAGGACCACCACGA，130 bp。按Q=2-ΔΔCt公式計算各組目的基因的相對表達量。

1.9統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism5軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1脊髓損傷60 d后尾部痙攣評分結果 SCI組18只大鼠均達到4～5分標準，并出現(xiàn)如下表現(xiàn)：其中有大鼠尾部肌張力高，出現(xiàn)S形，可持續(xù)陣攣10 min以上；有大鼠整個尾部打卷明顯，尾尖部打卷最大可達到180～360°并每次可持續(xù)10 min以上，陣攣幅度和強度顯著；還有大鼠尾部強烈陣攣，肌張力增高，持續(xù)10 min以上，并伴有大鼠尾部左右擺動鞭打。Sham組18只大鼠：對于刮擦大鼠尾部反應非常弱，無痙攣，肌肉活動和協(xié)調性良好，能保持尾巴直線，見圖1。

圖1 術后60 d大鼠尾部痙攣評分

2.25-HT1DR免疫熒光染色結果 在Sham組和SCI組脊髓中，5-HT1DR均主要在脊髓灰質的DH、IMZ和VH 3個區(qū)域中表達，且均在IMZ和VH區(qū)的表達較強，在DH區(qū)表達較弱，見圖2，表1。3個區(qū)域中，5-HT1DR在SCI組脊髓中的光密度值較Sham組均降低，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表1。陰性對照結果，未檢測到特殊免疫熒光染色。

A1～B1、A2～B2、A3～B3分別為脊髓灰質DH、IMZ和VH區(qū)域圖2 術后60 d兩組脊髓中5-HT1DR蛋白表達和分布(免疫熒光染色法A、B，×10；A1～A3、B1～B3，×20)

表1 兩組脊髓內5-HT1DR免疫熒光光密度定量分析

2.3Western印跡檢測5-HT1DR蛋白及mRNA表達比較 與Sham組比較，SCI組脊髓內5-HT1DR蛋白及mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 Western印跡檢測5-HT1DR蛋白表達

表2 兩組脊髓中5-HT1DR的蛋白及mRNA相對表達量

3 討 論

SCI后痙攣機制存在多種假說〔3〕。有研究認為，SCI引起的痙攣與運動神經(jīng)元過度興奮有關，SCI后脊髓腹角運動神經(jīng)元對5-HT敏感性增強，5-HT激活其受體產生持續(xù)性內向電流PICs(PICs)，PICs通過維持運動神經(jīng)元放電產生不自主肌肉收縮抽搐(痙攣)〔12〕。D′Amico等〔12〕發(fā)現(xiàn)5-HT1B/D受體激活可降低單突觸和多突觸反射途徑中的感覺傳遞，從而最終降低SCI后痙攣的觸發(fā)。Lucas-Osma等〔8〕研究報道，5-HT1DR通過調節(jié)C纖維活性來間接抑制單突觸反射，這為通過疼痛相關通路來調節(jié)SCI后痙攣開辟了新的可能性。Murray等〔13〕進行了SCI后運動神經(jīng)元的PICs和痙攣相關聯(lián)的5-HT受體的系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)5-HT2B和5-HT2C受體參與其中，尤其是改變5-HT2B受體的活性，為控制SCI后的痙攣提供了一種思路。綜上所述的這些痙攣機制，5-HT或其受體均參與其中，對SCI后痙攣的發(fā)生也具有重要意義。

5-HT1B受體在一定程度上參與了SCI后AADC細胞發(fā)生功能改變從而影響SCI后痙攣發(fā)生的機制〔11〕。而5-HT1DR和 5-HT1B受體同為G蛋白耦聯(lián)受體，結構極為相似且可能共同起作用〔6〕，因此考慮5-HT1DR可能也在一定程度上參與此痙攣機制，有待進一步研究。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的研究顯示，5-HT1DR廣泛存在于大腦和脊髓中。Bonaventure等〔14〕采用定量原位雜交和受體放射自顯影技術，觀察到大鼠嗅結節(jié)，內嗅皮層，小腦，三叉神經(jīng)中腦核，三叉神經(jīng)節(jié)和脊髓第Ⅹ板層都有5-HT1DR表達。通過反轉錄PCR方法，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在頸、胸、 腰、 骶段脊髓的背角和腹角都有5-HT1DR mRNA表達〔15〕。研究發(fā)現(xiàn)SCI患者痙攣常會伴發(fā)疼痛，兩者會同時出現(xiàn)，可能存在共同的潛在機制，SCI后疼痛和痙攣的治療可能互相有提示作用〔16〕。5-HT1DR與疼痛方面也有廣泛研究，有研究表明，5-HT通過激活5-HT1DR可以減輕神經(jīng)性疼痛〔17〕。通過激活位于脊髓和周圍部位5-HT1B/1D受體可抑制1%甲醛溶液誘導的痛覺〔18〕。研究表明，5-HT1DR對三叉神經(jīng)節(jié)內降鈣素基因相關肽的表達和釋放有重要的調節(jié)作用，且選擇性的5-HT1DR激動劑無血管收縮作用，可能會成為更安全有限的治療偏頭痛的藥物，有待研究〔19〕。

當然5-HT1DR還有在周圍系統(tǒng)中的研究，如：近期研究發(fā)現(xiàn)5-HT1DR存在于腸系膜靜脈中，可能有舒張血管的作用〔20〕。5-HT1B/1D受體激動劑可能有助于治療5-HT系統(tǒng)受損引起的各種病理性瘙癢〔21〕。近期已有研究表明，5-HT1DR有加重肝癌進展的作用，可能是肝癌潛在的治療靶點和判斷預后的預測因子〔22〕。

本研究結果推測5-HT1DR表達降低可能與SCI后痙攣發(fā)生相關，為SCI后痙攣機制提供新的研究思路。