劉 驊,王花花,王 珺,宮文武,丁 震,孫 備,許雷鳴,蒲 江
(1.安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院,安徽 合肥 230051;2.安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司,安徽 合肥 230088; 3.安徽省藥品監(jiān)督管理局,安徽 合肥 230051;4.安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230001)
重組新型冠狀病毒疫苗(CHO細(xì)胞)是由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所和安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司聯(lián)合研發(fā)的新冠病毒疫苗,也是目前世界唯一的重組型新型冠狀病毒疫苗。原理是將新冠病毒S蛋白受體結(jié)合區(qū)(RBD)即抗原蛋白基因重組到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞內(nèi),在體外表達(dá)形成RBD二聚體,再加氫氧化鋁佐劑以提高免疫原性。2021年3月10日批準(zhǔn)在中國(guó)國(guó)內(nèi)緊急使用。重組新型冠狀病毒疫苗生產(chǎn)采用工程化細(xì)胞(CHO)生產(chǎn)重組蛋白,該技術(shù)已在乙肝疫苗中使用,技術(shù)成熟,不需要高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)車(chē)間,生產(chǎn)工藝穩(wěn)定可靠,可快速實(shí)現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),顯著降低疫苗生產(chǎn)成本,且存儲(chǔ)和運(yùn)輸便捷。
注射劑內(nèi)毒素檢測(cè)方法的靈敏性及可靠性直接關(guān)系到用藥者的生命安全,特別是疫苗這一類用于健康人群接種的特殊藥品,內(nèi)毒素的控制更為嚴(yán)格,內(nèi)毒素的控制不僅是作為注射類藥品的控制要求,也是疫苗不良反應(yīng)的原因之一[1]。重組新型冠狀病毒疫苗(CHO細(xì)胞)現(xiàn)行內(nèi)毒素檢查標(biāo)準(zhǔn)是采用凝膠法。我們基于:(1)對(duì)內(nèi)毒素控制進(jìn)一步量化,產(chǎn)品質(zhì)量控制更加嚴(yán)格;(2)目前鱟被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物,2019年3月世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)正式宣布中華鱟“瀕危”[2]。意味著內(nèi)毒素檢測(cè)試劑原料將受到嚴(yán)格管控[3]。因此,尋求替代測(cè)試方法或者減少鱟試劑使用的方法迫在眉睫。本研究采用了微量鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法對(duì)該疫苗進(jìn)行內(nèi)毒素定量檢測(cè),并與現(xiàn)行凝膠法進(jìn)行比較。以期建立既節(jié)省鱟試劑又能定量檢測(cè)該疫苗內(nèi)毒素的方法。
1.1 藥品與試劑重組新型冠狀病毒疫苗(CHO細(xì)胞),批號(hào):A202105106、B202107162、D202107092,規(guī)格:1.0 mL每瓶(安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司)。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品,批號(hào):150601-201987,規(guī)格:80 EU每支(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。動(dòng)態(tài)顯色法(微量技術(shù))鱟試劑,批號(hào):2104080,規(guī)格:0.35 mL每支,定量范圍:10~0.01 EU·mL-1(湛江安度斯生物有限公司)。凝膠法鱟試劑,批號(hào):20091812,靈敏度:0.25 EU·mL-1,規(guī)格:0.1 mL每支(福州新北生化工業(yè)有限公司)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水),批號(hào):2002260,規(guī)格:50 mL每瓶(湛江安度斯生物有限公司)。
1.2 儀器細(xì)菌內(nèi)毒素檢查96孔反應(yīng)板(批號(hào)210106,湛江安度斯生物有限公司);全自動(dòng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)系統(tǒng),Endo Probe Robot 100(湛江安度斯生物有限公司);混旋儀,型號(hào)MS3digital(IKA公司),內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)。
2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素的限值企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:應(yīng)小于10 EU·mL-1。
2.2.1微量鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn) 取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支(80 EU每支),加入1.0 mL BET水溶解其內(nèi)容物,用封口膜將瓶口封嚴(yán),置漩渦混合器上混合15 min,得到細(xì)菌內(nèi)毒素初始濃度溶液(80 EU·mL-1),用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2.0、0.2、0.02 EU·mL-13個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照管。取4支動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑,按照說(shuō)明書(shū)要求,分別加入0.35 mL BET水復(fù)溶內(nèi)容物,吸取25 μL鱟試劑,加至96孔反應(yīng)板上,分別加上述系列濃度細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液25 μL與鱟試劑進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)濃度平行3管。軟件預(yù)設(shè)吸光度OD值0.1,反應(yīng)時(shí)間T為3 600 s,溫度(37±0.5)℃,檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm,以反應(yīng)時(shí)間T的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以濃度c的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算相關(guān)系數(shù)r值。根據(jù)鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法(微量技術(shù))說(shuō)明書(shū)的規(guī)定:標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù) |r| 應(yīng)≥0.980,CV系數(shù)≤20%,試驗(yàn)方為有效。測(cè)得數(shù)據(jù)經(jīng)線性回歸分析,得回歸方程:lgT=-0.302 7 lgC+2.858 7,|r|= 0.998 9。變異系數(shù)均小于20%,標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度均大于陰性對(duì)照管內(nèi)毒素含量,標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間為2 538 s。見(jiàn)Tab 1。
Tab 1 Reliability test results of kinetic chromogenic assay standard curve
結(jié)果表明,本次試驗(yàn)結(jié)果可信,線性可靠。批號(hào)為2104080的鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法(微量技術(shù))符合要求。
2.2.2凝膠法鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn) 用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶解,置混旋儀混合15 min,依據(jù)中國(guó)藥典2020年版四部通則1 143方法進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn),見(jiàn)Tab 2。
Tab 2 Sensitivity recheck test results of TAL(gel-clot method)
結(jié)果表明:鱟試劑靈敏度在0.5~2.0λ(含0.5λ和2. 0λ)之間,符合中國(guó)藥典2020年版規(guī)定。
2.3 供試品動(dòng)態(tài)顯色法干擾預(yù)試驗(yàn)按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備0.4 EU·mL-1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,取供試品原液用BET水稀釋至10倍、20倍、40倍,分別與0.4 EU·mL-1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合,得到稀釋倍數(shù)為20倍、40倍、80倍的內(nèi)毒素終濃度為0.2 EU·mL-1供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液,用動(dòng)態(tài)顯色法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。見(jiàn)Tab 3。
Tab 3 Interference pre-test results
結(jié)果表明:供試品稀釋至20、40、80倍時(shí),回收率均在50%~200%,重組新型冠狀病毒疫苗(CHO細(xì)胞)在稀釋20倍及以上濃度時(shí),對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾作用,可進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。
2.4 供試品動(dòng)態(tài)顯色法干擾試驗(yàn)本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度為2.0、0.2、0.02 EU·mL-1,根據(jù)最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ,供試品限值L按10 EU·mL-1,λ按0.02 EU·mL-1,算得MVD為500倍。目前凝膠法中鱟試劑選用的靈敏度是0.25 EU·mL-1,計(jì)算稀釋倍數(shù)為40倍。為方便這兩個(gè)方法進(jìn)行比較,綜合各因素,我們選擇稀釋40倍來(lái)做正式干擾實(shí)驗(yàn)。
供試品溶液(溶液A)制備:用BET水將疫苗原液稀釋40倍。
供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液(溶液B)制備:取稀釋倍數(shù)為20倍的供試品溶液與等量的0.4 EU·mL-1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,即得稀釋倍數(shù)為40倍內(nèi)含0.2 EU·mL-1內(nèi)毒素的供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液。
內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶液C)制備:按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備終濃度為2.0、0.2、0.02 EU·mL-13個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
參照鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法(微量技術(shù))說(shuō)明書(shū),取溶液A、溶液B、溶液C、溶液D(BET水作為陰性對(duì)照)各25 μL,分別與加至反應(yīng)板內(nèi)的25 μL微量動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑反應(yīng),每個(gè)濃度設(shè)置兩個(gè)平行孔。反應(yīng)條件同“2.2.1”項(xiàng)。按線性回歸方程,計(jì)算溶液A的細(xì)菌內(nèi)毒素含量(ct)和溶液B的細(xì)菌內(nèi)毒素含量(cs),將0.2 EU·mL-1內(nèi)毒素濃度設(shè)為λm,再按下式計(jì)算回收率(R)。R應(yīng)在50%~200%之間。
R =(cs-ct)/λm×100%
結(jié)果表明,重組新型冠狀病毒疫苗(CHO細(xì)胞)在稀釋倍數(shù)為40倍時(shí),3批供試品的回收率均在50%~200%,表明在該稀釋倍數(shù)下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素及鱟試劑反應(yīng)沒(méi)有干擾作用,可進(jìn)行內(nèi)毒素定量檢查。
2.5 供試品動(dòng)態(tài)顯色法檢查根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果對(duì)供試品用BET水稀釋40倍后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè),方法同“2.4”項(xiàng)。見(jiàn)Tab 5。
Tab 4 Interference test results
Tab 5 Results of bacterial endotoxin (micro-dynamic chromogenic method)
結(jié)果表明:3批供試品的內(nèi)毒素含量均小于限值10 EU·mL-1,符合企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。
2.6 供試品凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查按中國(guó)藥典2020年版四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”凝膠限度試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[4],結(jié)果見(jiàn)Tab 6。
Tab 6 Results of gel-clot test of the samples
結(jié)果表明:3批供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。
本研究采用微量鱟試劑動(dòng)態(tài)顯色法對(duì)3批重組新冠疫苗進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)得內(nèi)毒素含量均低于限值,與凝膠法檢查結(jié)果一致。本研究中既考慮到鱟試劑的資源匱乏,選用微量鱟試劑檢測(cè),鱟試劑的使用量?jī)H為傳統(tǒng)方法的十分之一,大大減少了鱟試劑的使用。同時(shí)又采用定量方法對(duì)疫苗的成品內(nèi)毒素進(jìn)行含量檢測(cè),對(duì)內(nèi)毒素的質(zhì)量控制更加嚴(yán)格,進(jìn)一步保障了人民用苗安全。所使用的全自動(dòng)內(nèi)毒素檢測(cè)系統(tǒng),消除了人工加樣誤差,更加高效便捷,提高檢驗(yàn)效率。該方法可推廣使用到該疫苗的原料、半成品及佐劑的內(nèi)毒素檢測(cè)中。