虎杖苷調(diào)控PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬改善變應(yīng)性鼻炎

劉思奇，金海南，張雅琳，宋藝蘭，延光海，王重陽，金永德

(1. 吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點實驗室，延邊大學(xué)，吉林 延吉 133002； 2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 延吉 133002)

變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)與鼻黏膜炎癥反應(yīng)有關(guān)，是一種常見的異質(zhì)性疾病[1]。全球約有4億AR患者，尤其是在工業(yè)化國家，其發(fā)病率很高，并且呈上升趨勢。該疾病不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且治療AR具有巨大的社會成本[2]。目前，皮質(zhì)類固醇藥物仍是治療AR的首選基礎(chǔ)療法，但其副作用是無法忽視的。因此，迫切需要開發(fā)一種治療AR安全有效的方法。

線粒體自噬是一特殊的選擇性自噬模式，在應(yīng)激條件下，會對受損的線粒體選擇性地清除和吞噬[3]。研究表明[4]，線粒體損傷促進線粒體外膜上PINK1的累積，PINK1將細胞質(zhì)中的泛素連接酶Parkin招募到去極化的線粒體，通過泛素化線粒體蛋白和吞噬受損的線粒體刺激線粒體自噬，這一過程是維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常細胞生理功能的關(guān)鍵保護機制。線粒體功能障礙已被證實與過敏性疾病有關(guān)，包括變應(yīng)性皮炎和哮喘等[5-6]，線粒體自噬可以抑制線粒體誘導(dǎo)的炎癥，因此線粒體自噬可能在線粒體功能障礙和線粒體生物能量學(xué)紊亂中發(fā)揮重要作用[5]。目前，線粒體自噬在AR中的報道尚不充分，需要進一步探索。

虎杖苷(Polydatin, PD)(3, 40, 5-三羥基二苯乙烯-3-b-D-葡萄糖苷)是一種白藜蘆醇糖苷，是從虎杖根莖中提取的天然中藥成分[7]，具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化以及預(yù)防缺血/再灌注損傷等作用[8-9]。Li等[10]研究證實了PD通過激活Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬減輕急性呼吸窘迫綜合征。Zeng等[11]提出PD通過Nrf2介導(dǎo)的抗氧化作用可以緩解哮喘。據(jù)報道，PD通過靶向 Nrf2/HO-1通路抑制過敏性炎癥反應(yīng)，因此，PD可能是治療過敏性炎癥性疾病的一種潛在有效藥物[12]。本研究旨在闡明PD是否通過PINK1-Parkin信號通路調(diào)控線粒體自噬緩解AR，為臨床提供新的靶向治療藥物。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組整個實驗過程中的操作程序均按照《實驗動物管理條例》進行，并獲得延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(批準號：YB. NO20200614b0321214)，實驗動物使用許可證號SYXK(吉)2020-0009。選取32只無特定病原體(SPF)級雌性BALB/c小鼠，6～8周齡。隨機分為4組(n=8)，對照組， OVA組，PD低劑量(30 mg·kg-1)和高劑量(45 mg·kg-1)治療組。對照組小鼠于d 1、8、15腹腔注射0.3 mL PBS。其余3組按相同的時間表腹腔注射25 μL OVA(1 g·L-1)和50 μL氫氧化鋁的混合溶液 0.3 mL致敏。從d 22開始, OVA組、PD低、高劑量組連續(xù)滴鼻激發(fā)7 d，激發(fā)液為20 μL OVA(5 g·L-1), 對照組用等量PBS代替。此外，在d 22～29，PD組在每次激發(fā)前2 h處理小鼠。

1.2 小鼠鼻炎癥狀評估最后一次OVA刺激后，在15 min內(nèi)，于安靜環(huán)境中仔細記錄小鼠打噴嚏和鼻摩擦運動的總次數(shù)，并與對照組進行比較。

1.3 組織學(xué)分析鼻組織放于10%甲醛溶液在室溫下固定24 h，然后在EDTA脫鈣液中脫鈣 8～12天，石蠟包埋。連續(xù)切片(4 μm厚度)，脫蠟后，用蘇木精和伊紅染色。隨機選擇切片，在顯微鏡下拍攝，觀察鼻黏膜上皮的形態(tài)和鼻黏膜中嗜酸性粒細胞的浸潤情況。

1.4 細胞培養(yǎng)和處理人鼻黏膜上皮細胞(HNEpC)購買于吉妮歐生物科技公司(廣州)，在添加10% FBS(Gibco)的MEM培養(yǎng)基(Life)中，37 ℃、5% CO2的增濕空氣條件下培養(yǎng)。用100 μmol·L-1和200 μmol·L-1的PD分別處理治療組細胞1h后，給予10 μg·L-1的IL-13蛋白(Technologies)刺激細胞24 h。

為了抑制線粒體自噬，先用10 μmol·L-1線粒體自噬特異性抑制劑Mdivi-1[13]預(yù)處理細胞2 h，然后用200 μmol·L-1的PD處理治療組細胞1 h，最后給予10 μg·L-1的IL-13蛋白刺激細胞24 h。

1.5 線粒體分離使用線粒體分離試劑盒(Beyotime)對組織和細胞進行線粒體分離。在冰上均漿，然后4 ℃，12 000×g離心10 min，分離線粒體(Mito)蛋白質(zhì)，然后在-80 ℃下儲存以供Western Blot分析。

1.6 Western blot收集組織蛋白或細胞，在4 ℃下以12 000×g離心10 min。定量蛋白質(zhì)濃度后進行電泳。待電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加入一抗(PINK1、Parkin、TOM20、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、Cytochrome C)，4 ℃緩慢搖床過夜。洗膜，用相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h。最后，在暗室中使用增強化學(xué)發(fā)光(ECL)可視化條帶，觀察蛋白表達。

1.7 免疫熒光分析處理后的細胞用4 ℃的甲醇固定20 min，在室溫下用5% BSA封閉1 h，然后 0.2% Triton滲透20 min。與一抗PINK1、cleaved caspase-3在4 ℃下過夜，然后用相應(yīng)的二抗孵育，37 ℃，2 h。由Cytaion 5拍攝熒光圖像。使用Image J軟件，選擇相應(yīng)的熒光通道和測量閾值，每張圖像確定細胞位置，記錄數(shù)據(jù)并計算。

2 結(jié)果

2.1 PD減輕小鼠的鼻部過敏癥狀，抑制小鼠鼻黏膜上皮炎癥浸潤為了探討PD在AR中的作用，我們通過腹腔注射和滴鼻建立了AR小鼠模型，最后一次OVA鼻內(nèi)刺激后，在15 min內(nèi)記錄小鼠打噴嚏和撓鼻的頻率。結(jié)果顯示，OVA誘導(dǎo)的AR 小鼠過敏癥狀顯著增加(P<0.05)，PD治療后模型組小鼠打噴嚏和撓鼻的次數(shù)明顯減少(P<0.05；Fig 1A)。鼻組織HE染色的結(jié)果顯示在OVA誘導(dǎo)的AR模型中鼻黏膜上皮顯著增厚，黏膜下的嗜酸性粒細胞聚集增加，而PD抑制了這些改變，見Fig 1B。

Fig 1 Nasal symptoms and histological changes in murine model of A: the frequency of sneezing and nasal rubbing in each group of murine(n=8); B: HE staining of nasal mucosa sections. Scale bar=500 μm. High magnification of the boxed areas was shown below. Scale bar=200 μm. The arrows indicated eosinophils(n= 4). **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs OVA-induced group.

2.2 PD激活OVA誘導(dǎo)的AR小鼠的線粒體自噬并抑制線粒體凋亡我們通過Western blot檢測了PINK1、Parkin、TOM20和線粒體凋亡相關(guān)蛋白的水平。結(jié)果顯示，相比對照組，予以O(shè)VA刺激后，PINK1、Parkin、Bax、caspase-3、cleaved-caspcase-3、Cytochrome C在AR小鼠鼻黏膜組織中高度表達(P<0.05)， TOM20和Bcl-2的水平降低(P<0.05)，PD治療后上調(diào)了PINK1、Parkin、Bcl-2的水平(P<0.05)，而TOM20和促凋亡蛋白Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、Cytochrome C的表達減少(P<0.05；Fig 2A、B)。

Fig 2 Expression of PINK1, Parkin, TOM20, Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved-caspase-3 and Cytochrome C in each n=4)A, B : Western blot analysis was used to detected the expression of PINK1, Parkin、TOM20、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3 and Cytochrome C in murine. **P<0.01 vs control group;#P<0.05, ##P<0.01 vs OVA-induced group.

2.3 IL-13刺激的HNEpCs中PINK1、Parkin、TOM20和凋亡相關(guān)蛋白的表達對于線粒體自噬相關(guān)蛋白的免疫印跡分析，我們可以看出，與對照組相比，予以IL-13處理后，PINK1、Parkin和促凋亡蛋白表達增加(P<0.05)，PD進一步增加了PINK1、Parkin的表達(P<0.05)，而抑制了促凋亡蛋白的水平(P<0.05)。并且200 μmol·L-1比100 μmol·L-1的PD治療效果更明顯。IL-13 刺激后，線粒體膜蛋白TOM20和Bcl-2水平降低(P<0.05)，PD加速了TOM20的降解(P<0.05)，上調(diào)了Bcl-2的水平(P<0.05；Fig 3A、B)。免疫熒光結(jié)果如預(yù)期一樣，IL-13上調(diào)了PINK1和cleaved-caspase-3的水平(P<0.05)，PD組PINK1的表達進一步升高(P<0.05)，而cleaved-caspase-3的表達下降(P<0.05；Fig 3C、D)。

Fig 3 Expression of PINK1, Parkin, TOM20 and apoptosis-related proteins in IL-13-stimulated n=3)After treated with different concentration of polydatin (100 μmol·L-1 and 200 μmol·L-1) for 1h, HNEpCs were stimulated with 10 μg·L-1 IL-13 for 24 h. A,B: Protein expressions of PINK1, Parkin, TOM20, Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved-caspase-3 and Cytochrome C in HNEpCs treated with IL-13 were determined by Western blot; C,D: Immunofluorescence assay was performed for PINK1 and cleaved-caspase-3. **P<0.01 vs untreated group; #P<0.05,##P<0.01 vs IL-13-stimulated group.

2.4 Mdivi-1預(yù)處理后HNEpCs中PINK1、Parkin、TOM20和凋亡相關(guān)蛋白的表達Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，Mdivi-1處理后，PINK1、Parkin、Bcl水平降低(P<0.05)，TOM20 的表達升高(P<0.05)，有趣的是，Mdivi-1抑制線粒體自噬后，PD對上述蛋白的表達沒有顯著影響(P>0.05；Fig 4A、B)。在免疫熒光中，我們發(fā)現(xiàn)，Mdivi-1處理后，抑制了PINK1的表達(P<0.05)，此時PD的治療作用不明顯(P>0.05；Fig 4C)，而cleaved-caspase-3在予以Mdivi-1處理后，表達量明顯提高(P<0.05)，PD治療后沒有顯著影響(P>0.05；Fig 4D)。

Fig4 Expression of PINK1, Parkin, TOM20 and apoptosis-related proteins in IL-13-stimulatedHNEpCs after Mdivi-1 After pretreated with Mdivi-1 (10 μmol·L-1) for 2 h, HNEpCs were treated with polydatin (200 μmol·L-1) for 1 h, and then stimulated with 10 μg·L-1 IL-13 for 24 h. A, B : Expressions of PINK1, Parkin, TOM20 and apoptosis-related proteins in HNEpCs treated with IL-13 were measured by Western blot; C,D: Immunofluorescence assay was performed for PINK1 and cleaved caspase-3. **P<0.01 vs untreated group; ##P<0.01 vs IL-13-stimulated group.

3 討論

AR是臨床常被患者忽視且很難有效控制的過敏性疾病，是哮喘、中耳炎、睡眠呼吸暫停等許多并發(fā)癥的基礎(chǔ)，嚴重影響患者生活質(zhì)量和社會生產(chǎn)力[2]。隨著健康意識的提高，人們越來越傾向于通過科學(xué)的飲食來防治疾病。因此，PD作為具有抗炎、抗過敏[8]等一系列藥物功能的天然植物成分已經(jīng)應(yīng)用于許多疾病的治療。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)，OVA誘導(dǎo)的AR小鼠撓鼻和打噴嚏的次數(shù)較對照組明顯增多，PD緩解了AR小鼠鼻部臨床過敏癥狀，從HE染色結(jié)果中可以觀察到，PD減輕了鼻黏膜上皮增厚和嗜酸性粒細胞浸潤。

線粒體激酶PINK1和E3-泛素(Ub)連接酶Parkin是參與線粒體自噬兩種最核心的蛋白，在健康的機體中，PINK1會被迅速降解，因此含量很低[14]。應(yīng)激條件下，線粒體外膜(TOM)復(fù)合物轉(zhuǎn)位酶PINK1輸入阻滯，導(dǎo)致其泛素激酶活性通過自身磷酸化激活，并啟動Parkin依賴的線粒體清除。PINK1磷酸化的Ub結(jié)合Parkin的RING1結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)了對Parkin的磷酸化，激活Parkin后，將其從細胞質(zhì)中易位[4]。Cao等[15]表明，姜黃素通過AMPK-TFEB信號通路激活Parkin依賴的線粒體自噬以改善腸道屏障線粒體損傷。Li等[16]研究認為激活PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可以減輕細胞線粒體凋亡，從而加速肺血管重塑。Lin[17]和同事證實，Pink1-Parkin通路誘導(dǎo)的線粒體自噬可以抑制線粒體ROS和NLRP3炎癥小體來緩解造影劑引起的急性腎損傷。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了在AR小鼠鼻黏膜組織和HNEpC細胞中，模型組PINK1和Parkin高度表達，PD治療后進一步上調(diào)了PINK1/Parkin的水平，激活了線粒體自噬。然后，我們用Mdivi-1處理HNEpCs，Mdivi-1是一種被廣泛接受的線粒體自噬的特異性抑制劑，通過阻斷動力1樣蛋白(DNM1L，線粒體裂變和隨后的線粒體自噬消除的關(guān)鍵調(diào)控因子)抑制線粒體自噬[13]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin表達顯著降低，線粒體自噬減少，而PD治療對這些變化沒有顯著影響。基于以上結(jié)果，提示抑制線粒體自噬可以減弱PD對PINK1/Parkin通路的激活，進一步確定PD改善AR是通過PINK1-Parkin這一途徑實現(xiàn)的。

此外，線粒體自噬與凋亡的相互調(diào)節(jié)對維持線粒體網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，線粒體是調(diào)控凋亡的中心環(huán)節(jié)，同時Bcl-2家族也密切參與線粒體自噬功能[18]。在凋亡早期，促凋亡蛋白增加，Bax轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)層，通過連續(xù)級聯(lián)誘導(dǎo)Cytochrome C和caspases-3，最終導(dǎo)致細胞死亡[19]。因此，細胞的抗凋亡防御策略，可以減輕線粒體凋亡對機體的有害影響。該研究中，在OVA誘導(dǎo)的AR小鼠和IL-13刺激的HNEpC中，PD均可抑制促凋亡蛋白，包括Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3和Cytochrome C，使抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加，從而我們得出PD作為抑制劑發(fā)揮其生物學(xué)作用減少凋亡從而緩解AR。PD的抗凋亡作用也已在其他疾病中得到證實[20-21]。Tong等[21]提出PD抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，以減少海馬細胞凋亡。我們通過線粒體自噬的特異性抑制劑Mdivi-1觀察了線粒體自噬對線粒體凋亡的影響，結(jié)果中可以看出，Mdivi-1可以促進IL-13誘導(dǎo)的促凋亡蛋白的積累，抑制Bcl-2的水平，PD沒有逆轉(zhuǎn)以上蛋白的表達。這些結(jié)果說明IL-13促凋亡是通過線粒體自噬-線粒體凋亡途徑介導(dǎo)的。

總之，PD可能通過調(diào)節(jié)PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬緩解AR。值得注意的是，線粒體自噬是一個十分復(fù)雜的過程。目前，線粒體自噬作用尚不能完全闡述，需要進一步探索。本項研究提高了我們對PD在AR中的作用和認識，為AR提供了新的治療策略。