早期動(dòng)脈粥樣硬化中炎癥細(xì)胞的分布情況

王 隱，趙庭瑞，鄒 瑤，于 超，王婷婷

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400016)

根據(jù)《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019概要》，我國(guó)現(xiàn)患心血管病的人數(shù)約有3.30億，患病率及死亡率仍處于上升階段；同時(shí)，無(wú)論在農(nóng)村還是城市，其死亡率都居于首位，高于腫瘤和其他疾病[1]。心血管疾病的根本病因是動(dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈粥樣硬化是一種全身慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與炎癥、高脂血癥及血流動(dòng)力學(xué)改變等密切相關(guān)[2]。目前的研究表明[3]，免疫系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。在疾病發(fā)展的過(guò)程中，攜帶膽固醇的低密度脂蛋白觸發(fā)炎癥反應(yīng)，引起T細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生等，將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)化為促炎或抗炎的表型，并引導(dǎo)不同免疫細(xì)胞之間的相互作用，最終影響斑塊的穩(wěn)定性，并引起臨床癥狀，如心肌梗塞和中風(fēng)。

在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，局部微環(huán)境會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的變化，并伴有多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)[4]。免疫系統(tǒng)包括固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，固有免疫細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、單核巨/噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞等，適應(yīng)性免疫細(xì)胞主要包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。Th17細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的亞群之一，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多個(gè)炎性疾病中可以分泌IL-17等細(xì)胞因子發(fā)揮重要作用[5]，Tc17細(xì)胞作為CD8+T細(xì)胞的亞群之一,也有相同作用。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，眾多免疫細(xì)胞涉及其中，這些細(xì)胞的生成、成熟及分裂分化等生命過(guò)程發(fā)生在不同的組織器官，不同階段的細(xì)胞在疾病進(jìn)程中有不同的功能，因此了解細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠全身免疫系統(tǒng)微環(huán)境中的分布至關(guān)重要。目前關(guān)于免疫應(yīng)答在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究主要集中于研究各種免疫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中晚期的作用[6]，而在對(duì)早期動(dòng)脈粥樣硬化中除巨噬細(xì)胞外的其他炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況研究較少。因此，本研究運(yùn)用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，構(gòu)建早期動(dòng)脈粥樣硬化模型，檢測(cè)早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈、外周血、脾臟和骨髓中各種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況及表型，以期闡明早期動(dòng)脈粥樣硬化中主要的固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的分布情況。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象高脂飲食(含0.15%的膽固醇，MD12015，購(gòu)自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司)喂養(yǎng)4周的雄性ApoE-/-小鼠(6只，6w，C57BL/6背景，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004)作為實(shí)驗(yàn)組，正常飲食(購(gòu)自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司)喂養(yǎng)4周的同等大小的雄性C57BL/6小鼠[6只，從重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心獲得，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(渝)2018-0003]作為對(duì)照組。所有小鼠都是在特定的無(wú)病原體條件(IVC環(huán)境)下飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理與實(shí)驗(yàn)委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑：抗小鼠CD45抗體(103114；103155)、Ly6G抗體(127605)、CD11b抗體(101225)、CD117抗體(105823)、FcεRIα抗體(134307)、NK1.1抗體(108736)、F4/80抗體(123108)、CD80抗體(104714)、CD3抗體(100222)、CD4抗體(100433)、CD8抗體(140416)購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，抗小鼠CD163抗體(2006514)、IL-17A抗體(2142931)購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，膠原酶Is(C1639)，膠原酶XI(C5138)，Ⅰ型DNA酶(10104159001)和透明質(zhì)酸酶(H3506-100MG)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，紅細(xì)胞裂解液(RT122-02)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，中性樹脂(1118D021)、飽和油紅O染液(G1260)及Masson三色染色試劑盒(G1340)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，蘇木精(ZLI9610)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ixation/Permeabilization Kit(554714)購(gòu)自美國(guó)BD公司，cell activation cocktail (with Brefeldin A，423303)購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，RPMI1640培養(yǎng)基(21870076)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，組織固定液(含1%DEPC，AR1069)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清(A6500-3011)購(gòu)自德國(guó)Cegrogen公司，異戊巴比妥鈉(Phenobarbital Sodium Salt，57-33-0)購(gòu)自北京Notlas公司，PBS磷酸鹽粉劑(B040100-0005)購(gòu)自生工生物工程有限公司，肝素鈉鹽(A603251-1001)購(gòu)自生工生物工程有限公司，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)定試劑盒(0302105-000464-00)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒(0302105-000463-00)、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(0302105-000448-00)、甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(0302105-000449-00)均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：流式細(xì)胞儀(Cytoflex S，美國(guó)BECKMAN COULTER公司)，光學(xué)顯微鏡(718026，日本Nikon公司)，生化分析儀(BS-220，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，純水儀(F0MB10660，美國(guó)Millipore公司)，低溫離心機(jī)(Microfuge 20R，美國(guó)BECKMAN COULTER公司)。

1.3 組織樣本處理將ApoE-/-和C57小鼠用200 μL異戊巴比妥鈉(3.75 g·L-1)腹腔麻醉后，用含肝素鈉的聚丙乙烯管采集小鼠眼眶血并處死。心臟穿刺，用無(wú)菌2% PBS-肝素鈉溶液完全灌注，沖洗心臟及所有血管中的血液。切除心臟并用組織固定液固定。收集脾臟、主動(dòng)脈(包括胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈)、股骨和脛骨于無(wú)菌PBS溶液中。將主動(dòng)脈剪成小塊，轉(zhuǎn)移至酶混合物工作液(包含各25 μL 450 kU·L-1的膠原酶Is、125 kU·L-1的膠原酶XI、60 kU·L-1的Ⅰ型DNA酶和60 kU·L-1的透明質(zhì)酸酶的預(yù)冷PBS溶液)中，37 ℃下消化1 h[7]；從股骨和脛骨收集骨髓。消化后的主動(dòng)脈、骨髓以及脾臟分別經(jīng)研磨棒和200目鋼網(wǎng)加工制成單細(xì)胞懸液，便于后續(xù)流式細(xì)胞染色。離心外周血，2 000 r·min-1，5 min，取上層血清用于血脂水平檢測(cè)，下層血細(xì)胞則用于流式細(xì)胞染色。將心臟進(jìn)行石蠟包埋或冰凍制成切片，厚約7 μm。

1.4 血脂水平檢測(cè)使用生化分析儀和相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠血清血脂水平，包括總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白-膽固醇和高密度脂蛋白-膽固醇。

1.5 流式細(xì)胞染色及分析細(xì)胞表面分子流式染色：分別用PE/Cy7標(biāo)記的CD45抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Ly6G抗體，APC/Cy7標(biāo)記的CD11b抗體，Percp/Cy5.5標(biāo)記的CD117抗體，PE標(biāo)記的FcεRIα抗體，BV650標(biāo)記的NK1.1抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的F4/80抗體，APC標(biāo)記的CD80抗體，PE標(biāo)記的CD163抗體標(biāo)記主動(dòng)脈、脾臟和骨髓組織單細(xì)胞懸液以及新鮮外周血細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞CD45+(Ly6G+CD11b+)、肥大細(xì)胞CD45+(CD117+FcεRIα+)、自然殺傷細(xì)胞(CD45+NK1.1+)、巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+)、M1型巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD80+)及M2型巨噬細(xì)胞(CD45+F4/80+CD163+)，4 ℃放置30 min后，100 μL staining buffer(含1%FBS的PBS溶液)洗滌1次，1 800 r·min-1離心5 min，50 μL胎牛血清封閉30 min；100 μL staining buffer洗滌1次，1 800 r·min-1，離心5 min；100 μL組織固定液(含1% DEPC)固定，4 ℃，20 min;100 μL staining buffer洗滌1次，1 800 r·min-1離心5 min;棄上清，150 μL PBS溶液重懸細(xì)胞，待上機(jī)；外周血染色后需先裂解其中紅細(xì)胞再進(jìn)行固定。細(xì)胞內(nèi)因子染色：將主動(dòng)脈、脾臟和骨髓組織單細(xì)胞懸液以及新鮮外周血細(xì)胞用cell activation cocktail (with Brefeldin A)刺激6 h，用BV605標(biāo)記的CD45抗體，APC/Cy7標(biāo)記的CD3抗體，BV650標(biāo)記的γδ TCR抗體和PE/Cy7標(biāo)記的CD8抗體分別標(biāo)記不同組織器官中的T細(xì)胞(CD45+CD3+)，CD4+T細(xì)胞(CD45+CD3+CD8-γδ T-)和CD8+T細(xì)胞(CD45+CD3+CD8+γδ T-)，4 ℃放置30 min后，100 μL staining buffer洗滌1次，1 800 r·min-1離心5 min，50 μL胎牛血清封閉30 min；100 μL staining buffer洗滌1次，1 800 r·min-1，離心5 min；Fixation and Permeabiliation solutionn固定通透20 min，100 μL wash buffer (1×Perm/Wash solution)洗滌1次，1 800 r·min-1離心5 min，APC標(biāo)記的IL-17A抗體標(biāo)記CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分泌的IL-17，4 ℃放置30 min后，100 μL wash buffer洗滌1次，1 800 r·min-1離心5 min;棄上清，150 μL PBS 溶液重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析各樣本中免疫細(xì)胞的比例。流式門控策略如Fig 1所示。

Fig 1 Gating strategy of flow cytometry

1.6 組織切片染色心臟冰凍切片油紅O染色：室溫復(fù)溫30 min，油紅O染色工作液(油紅0染料 ∶超純水=3 ∶2，體積比)，37 ℃，30 min。棄去染液，超純水洗去多余染液；60%異丙醇脫色30 s，超純水終止分化；蘇木精染液復(fù)染細(xì)胞核1 min，超純水返藍(lán)；中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。心臟石蠟切片Masson染色：二甲苯脫蠟2次，每次10 min，酒精梯度水化各5 min，Weigert鐵蘇木精染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化液分化5～15 s，水洗，Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min，水洗，純水洗1 min，麗春紅品紅染色液染色5～10 min，弱酸工作液(純水 ∶弱酸溶液=2 ∶1)，磷鉬酸溶液洗1～2 min，用配置好的弱酸工作液洗1 min，直接入苯胺藍(lán)染色液中染色1～2 min，弱酸工作液洗1 min，95%乙醇快速脫水，無(wú)水乙醇脫水3次，二甲苯透明3次，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠4周，建立早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，在血管部位有粥樣斑塊合并病變，管腔輕度梗阻，血管平滑肌細(xì)胞無(wú)明顯遷移或受累[8]。油紅O染色顯示，與C57小鼠相比，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積明顯增加(Fig 2A，2B)；而膠原纖維含量(Fig 2C，2D)沒(méi)有差異。運(yùn)用生化分析儀檢測(cè)小鼠血脂水平發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠的血脂(包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯高于C57小鼠(Fig 2E)。以上結(jié)果表明動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型構(gòu)建成功。

Fig 2 Validation of a mouse model of atherosclerosisA, B:Comparison of Oil red O staining and plaque area size in mouse aortic root. C, D:Masson′s staining and collagen content quantification in mouse aortic root. E:Serum lipid levels of n=6). *P<0.05, **P<0.01 vs C57.

2.2 早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的檢測(cè)及分析收集小鼠整條主動(dòng)脈，制成單細(xì)胞懸液，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示：ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的比例均明顯高于C57小鼠；進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞的表型發(fā)現(xiàn)，具有促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞在ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中浸潤(rùn)明顯增加；而具有抗炎作用的M2型巨噬細(xì)胞的比例無(wú)明顯變化(Fig 3A，3B)。進(jìn)一步分析T細(xì)胞及其亞型發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈中浸潤(rùn)的CD3+T細(xì)胞(Fig 3C，3D)、IL-17+CD4+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)(Fig 3E，3F)及IL-17+CD8+T細(xì)胞(Tc17細(xì)胞)(Fig 3G，3H)的比例均較C57小鼠主動(dòng)脈中明顯升高。以上結(jié)果說(shuō)明在早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈中，不管是固有免疫細(xì)胞還是適應(yīng)性免疫細(xì)胞，均有不同程度的浸潤(rùn)增加。提示免疫細(xì)胞在早期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中發(fā)揮潛在作用。

Fig 3 Infiltrating immune cells and phenotypes in aorta of mice with early atherosclerosisDetection and quantification of innate immune cells (A, B), T cells (C, D), Th17 cells (E, F) and Tc17 cells (G, H) in aorta. n=6). 1:neutrophils;2:mast cells;3:NK cells;4:macrophages;5:M1-macrophages;6:M2-macrophages.*P<0.05, **P<0.01 vs C57.

2.3 早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠外周血中免疫細(xì)胞的檢測(cè)及分析血液在心臟和血管腔循環(huán)流動(dòng)，可以參與運(yùn)輸、防御、調(diào)節(jié)人體滲透壓等過(guò)程。血液中的白細(xì)胞豐富，既可以殺滅細(xì)菌、病毒等病原體，也參與形成慢性疾病的炎性狀態(tài)。對(duì)ApoE-/-小鼠和C57小鼠外周血進(jìn)行流式染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ApoE-/-小鼠外周血中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例與C57小鼠相比，均有升高趨勢(shì)，其中肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞比例顯著升高(Fig 4A，4B)；進(jìn)一步分析單核細(xì)胞表型，結(jié)果顯示ApoE-/-小鼠外周血中M1樣單核細(xì)胞比例有升高趨勢(shì)，M2樣單核細(xì)胞比例有下降趨勢(shì)。小鼠外周血T細(xì)胞及表型分析顯示：ApoE-/-小鼠外周血中中T細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例顯著增加，而Tc17細(xì)胞也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)(Fig 4C-H)。

Fig 4 Immune cells and phenotypes in peripheral blood of mice with early atherosclerosisDetection and quantification of innate immune cells (A, B), T cells (C, D), Th17 cells (E, F) and Tc17 cells (G, H) in blood. n=6).1:neutrophils;2:mast cells;3:NK cells;4:monocytes;5:M1-monocytes;6:M2-monocytes. **P<0.01 vs C57.

2.4 早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠脾臟中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的檢測(cè)及分析脾臟作為次級(jí)淋巴器官，其白髓由密集的淋巴細(xì)胞組成，是機(jī)體發(fā)生特異性免疫應(yīng)答的主要場(chǎng)所；紅髓是免疫細(xì)胞發(fā)生吞噬作用的主要場(chǎng)所；邊緣區(qū)有較多巨噬細(xì)胞，是脾內(nèi)捕獲、識(shí)別抗原，誘發(fā)免疫應(yīng)答的重要部位，因此脾臟是動(dòng)脈粥樣硬化病變炎性細(xì)胞的重要應(yīng)答器官。對(duì)ApoE-/-小鼠和C57小鼠脾臟單細(xì)胞懸液的流式結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：小鼠脾臟中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比例在兩組小鼠中無(wú)差異；而ApoE-/-小鼠脾臟中自然殺傷細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞比例明顯高于C57小鼠中(Fig 5A，5B)。T細(xì)胞的分析結(jié)果顯示：ApoE-/-小鼠脾臟中浸潤(rùn)的T細(xì)胞(Fig 5C，5D)和Th17細(xì)胞(Fig 5E，5F)比例有上升趨勢(shì)，Tc17細(xì)胞(Fig 5G，5H)比例明顯增加。

Fig 5 Immune cells and phenotypes in spleen of mice with early atherosclerosisDetection and quantification of innate immune cells (A, B), T cells (C, D), Th17 cells (E, F) and Tc17 cells (G, H) in spleen. n=6).1:neutrophils;2:mast cells;3:NK cells;4:macrophages;5:M1-macrophages;6:M2-macrophages. *P<0.05, **P<0.01 vs C57.

2.5 早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠骨髓中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的檢測(cè)及分析骨髓是免疫細(xì)胞的生成器官，紅骨髓除了具有活躍的造血功能外，還具有防御、免疫、創(chuàng)傷修復(fù)等功能。骨髓細(xì)胞成分復(fù)雜，包括各種血細(xì)胞系的不同發(fā)育階段的細(xì)胞，如占40%～60%的粒細(xì)胞系，約20%的巨核細(xì)胞系等。在對(duì)ApoE-/-小鼠和C57小鼠骨髓單細(xì)胞懸液的流式結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)：ApoE-/-小鼠和C57小鼠骨髓中生成的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞比例無(wú)明顯差異；雖然ApoE-/-小鼠骨髓中肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞比例明顯高于C57小鼠，但總體比例偏低(Fig 6A，6B)。兩組小鼠間T細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞比例均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Fig 6C-H)。

Fig 6 Immune cells and phenotypes in bone marrow of mice with early atherosclerosisDetection and quantification of innate immune cells (A, B), T cells (C, D), Th17 cells (E, F) and Tc17 cells (G, H) in bone marrow. n=6). 1:neutrophils;2:mast cells;3:NK cells;4:monocytes;5:M1-monocytes;6:M2-monocytes. **P<0.01 vs C57.

3 討論

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈和外周血中，除了單核/巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加，其他固有免疫細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等的比例也有顯著增加的趨勢(shì);進(jìn)一步分析單核/巨噬細(xì)胞的表型發(fā)現(xiàn)，主動(dòng)脈和外周血中的單核/巨噬細(xì)胞以發(fā)揮促炎作用的M1型表型為主；而在發(fā)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的脾臟中，固有免疫細(xì)胞的數(shù)量較少且在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠和正常小鼠中無(wú)差異；此外，在免疫細(xì)胞的生成器官骨髓中，固有免疫細(xì)胞的比例在兩組小鼠中也無(wú)差異。并且在早期動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中，部分適應(yīng)性細(xì)胞——T細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞在主動(dòng)脈、外周血和脾臟的比例明顯增加，而在骨髓中的比例無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的早期，動(dòng)脈壁的脂質(zhì)沉積主要促進(jìn)了固有免疫細(xì)胞的募集和促炎作用的增強(qiáng)，而并未影響其在骨髓中的生成。在脂蛋白相關(guān)抗原及固有免疫細(xì)胞的共同作用下，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的T細(xì)胞活化并增殖，進(jìn)一步促進(jìn)了血管壁炎性微環(huán)境的形成。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種由富含膽固醇的巨噬細(xì)胞在大中動(dòng)脈壁異常積聚,導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝異常和先天性和適應(yīng)性免疫對(duì)修飾性脂蛋白和受損血管壁成分的免疫反應(yīng)引起的復(fù)雜慢性炎性疾病。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)局部微環(huán)境[4]。斑塊中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)往往預(yù)示著其在其他組織器官的浸潤(rùn)情況同樣發(fā)生了變化。目前的研究表明，免疫細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用各異。在患有高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的患者以及動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細(xì)胞數(shù)量增加，并且與斑塊大小和斑塊分期相關(guān)[9]。單核細(xì)胞一旦滲入動(dòng)脈壁，它們就會(huì)分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在動(dòng)脈粥樣硬化患者破裂的斑塊和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，都發(fā)現(xiàn)了大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)[10]。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊局部多種促炎因子和抗炎因子的作用下，巨噬細(xì)胞的抗炎和促炎表型也處于不斷的動(dòng)態(tài)變化中[10]。在促炎細(xì)胞因子如IFN-γ、LPS等的作用下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎的M1表型，釋放大量炎性介質(zhì)如IL-1β、IL-6、TNF-α等，維持血管的慢性炎癥狀態(tài)進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。而在IL-4、IL-13等抗炎細(xì)胞因子的作用下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為抗炎的 M2 表型，通過(guò)釋放IL-10、TGF-β等免疫抑制分子，促進(jìn)局部炎癥的消退和組織的修復(fù)，從而發(fā)揮保護(hù)作用。巨噬細(xì)胞除了分泌細(xì)胞因子，還表達(dá)多種趨化因子，巨噬源性的CCL3和血小板來(lái)源的CCL5等趨化因子可以參與中性粒細(xì)胞的募集[11]，募集而來(lái)的中性粒細(xì)胞不僅可以參與炎癥細(xì)胞組織重塑，還能促進(jìn)其他白細(xì)胞進(jìn)入血管外組織的炎癥部位。除此之外，在炎性環(huán)境下，中性粒細(xì)胞還具有抗原呈遞細(xì)胞特性。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，中性粒細(xì)胞表面的MHC Ⅱ類分子表達(dá)上升并增加其抗原呈遞能力，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞激活[12]。固有免疫細(xì)胞除了中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞，還包括自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。肥大細(xì)胞是存在于黏膜和結(jié)締組織中的多能白細(xì)胞，人冠狀動(dòng)脈病理學(xué)研究表明，肥大細(xì)胞不僅存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，且與非破裂的斑塊相比，其數(shù)量在破裂的斑塊中明顯升高，影響纖維帽的穩(wěn)定性[13]。早期研究發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中有大顆粒狀的淋巴細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)浸潤(rùn)，當(dāng)小鼠體內(nèi)CD47缺乏，可引起自然殺傷細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞的激活，增加斑塊形成，從而加劇動(dòng)脈粥樣硬化[14]。因此，動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中涉及的固有免疫細(xì)胞及其作用的多樣性表明了動(dòng)脈粥樣硬化研究的復(fù)雜性及必要性。

適應(yīng)性免疫細(xì)胞，主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞，也是免疫細(xì)胞的組成部分。較多研究已證明活化的T細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中持續(xù)存在，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞分別被MHC Ⅱ類分子和MHC Ⅰ類分子提呈的抗原激活，會(huì)分化為功能不同的輔助T細(xì)胞亞型-Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、濾泡輔助T細(xì)胞(Tfh)以及殺傷T細(xì)胞亞型-Tc1細(xì)胞、Tc2細(xì)胞、Tc17細(xì)胞等。動(dòng)脈粥樣硬化是一種已知的Th1性疾病。斑塊中的許多CD4+T細(xì)胞會(huì)表達(dá)與Th1細(xì)胞相關(guān)的促炎細(xì)胞因子γ-干擾素(IFN-γ)、IL-2、IL-3、TNF-α等，這些細(xì)胞因子可以激活巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和其他細(xì)胞因子，從而加劇炎癥反應(yīng)[15]。此外，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，相當(dāng)大比例的T細(xì)胞表達(dá)Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13。在一項(xiàng)研究中，Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-4拮抗Th1反應(yīng)并減少了病灶的形成，而據(jù)報(bào)道耗竭IL-4對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用[16]。同樣，Th17細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用也存在爭(zhēng)議：Th17細(xì)胞的主要細(xì)胞因子IL-17作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，誘導(dǎo)促炎因子如IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和趨化因子如CCL2、CXCL1、CXCL8、CXCL10分泌增加，募集中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等到達(dá)斑塊部位，影響斑塊的穩(wěn)定性并增大血管壁損傷范圍[17]；而其他研究則報(bào)道，IL-17通過(guò)抑制IFN-γ和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)等的產(chǎn)生，減少單核細(xì)胞和T細(xì)胞在損傷部位的聚集，并誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型膠原等，從而控制損傷的發(fā)展并維持斑塊的穩(wěn)定性[18]。IL-17來(lái)源于多種免疫細(xì)胞，其中包括Th17細(xì)胞和Tc17細(xì)胞。這些研究中不同的發(fā)現(xiàn)反映了不同T細(xì)胞亞群在動(dòng)脈粥樣硬化中有迥異作用。

免疫應(yīng)答在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段都發(fā)揮重要作用。但目前各種免疫細(xì)胞在中晚期動(dòng)脈粥樣硬化階段的作用研究較為全面[6]，本研究系統(tǒng)地闡明了多種免疫細(xì)胞在早期動(dòng)脈粥樣硬化中的分布情況，對(duì)深入了解動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的免疫學(xué)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)；在全面而細(xì)致地研究動(dòng)脈粥樣硬化炎性微環(huán)境形成的機(jī)制及具體的作用機(jī)制方面具有重要意義。