芹菜素通過PDK1/AKT信號通路抑制小鼠肝纖維化

陳鑫棟，仲威龍，閆佩瑤，匡佳妮，喬鍇亮，孫 濤，黃 飚，秦 源

(1. 浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018；2. 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，天津市消化疾病研究所，天津市消化病學(xué)重點實驗室，天津 300052；3. 南開大學(xué)藥學(xué)院，藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室，天津 300350)

肝纖維化是一種肝臟的慢性疾病，晚期肝纖維化會發(fā)展為肝硬化與肝功能衰竭，全球每年有超過100萬人死于肝纖維化導(dǎo)致的終末期肝病[1]。目前，針對肝纖維化的主要治療思路包括：肝臟保護、抑制肝星狀細胞活性和調(diào)節(jié)免疫。盡管針對肝纖維化的藥物研究眾多，但目前臨床上缺乏治療肝纖維化的特異藥物，尚無FDA批準(zhǔn)的專門治療肝纖維化的藥物上市[2]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-nesenchymal transition，EMT)是指具有上皮屬性的細胞因某些因素的作用，導(dǎo)致細胞去極性，轉(zhuǎn)化為具有間充質(zhì)屬性細胞的過程。眾多研究顯示，EMT在肝纖維化形成過程中發(fā)揮了重要作用，抑制肝星狀細胞的EMT可以有效治療肝纖維化[3]。

黃酮類小分子是兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其廣泛存在于各種植物之中。多種黃酮分子具有保肝、護肝，抑制肝纖維化的作用[4-5]。目前，黃酮類分子水飛薊賓常在臨床上作為保肝藥物使用，也用于治療肝纖維化[6]。芹菜素也是一種典型的黃酮分子，其廣泛存在于各種蔬菜水果中，具有抗炎、抗癌等廣泛作用[7-8]。本團隊前期的研究發(fā)現(xiàn)[9]，芹菜素可以通過抑制肝癌細胞EMT，發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移的作用。但芹菜素對肝纖維化的治療作用和機制尚未有報道。由于芹菜素在日常的水果、蔬菜中含量豐富，其新的藥理機制的發(fā)現(xiàn)，不僅有助于新型保肝、抗肝纖維化藥物的研發(fā)，也有助于指導(dǎo)人們通過日常飲食，預(yù)防肝病的發(fā)生。本研究將對芹菜素治療肝纖維化的藥效和藥理機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與實驗動物芹菜素、水飛薊賓單體購自成都普思生物科技股份有限公司，CCl4及其他相關(guān)生化試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司(貨號：D0819)，RNA抽提試劑盒(貨號：R0026)、qRT-PCR試劑盒(貨號：D7268M)購自碧云天生物有限公司。用DMSO將芹菜素配制20 g·L-1母液，用生理鹽水稀釋成實驗所需濃度。醫(yī)用級玉米油購自西安晉湘藥用輔料有限公司(貨號：456)，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(貨號：C009-2-1)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)(貨號：C010-2-1)、白蛋白(ALB)(貨號：A028-2-1)及總蛋白(TP)(貨號：A045-2-2)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司)。

實驗動物為SPF級健康昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，實驗動物許可證號碼：0039483。磷酸化AKT(p-AKT S473，貨號：ab81283)、磷酸化PDK1(p-PDK1 S241，貨號：ab131098)蛋白抗體及免疫組化二抗(貨號：ab99697)均購于Abcam公司。

1.2 模型建立與給藥治療將60只小鼠置于SPF屏障環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用區(qū)間分組法將小鼠隨機分組：所有小鼠稱取體質(zhì)量后按大小排列編號，按序號依次分成10個區(qū)，隨機從每個區(qū)中取一只小鼠形成一個組，分為對照組、模型組、陽性對照水飛薊賓組(Silibinin組)、芹菜素低劑量組(Apigenin-L組)、芹菜素中劑量組(Apigenin-M組)、芹菜素高劑量組(Apigenin-H組)，每組10只。建模方案綜合參考了先前的研究并做了適當(dāng)調(diào)整[10-12]：對照組小鼠每只每次背部皮下注射玉米油2 mL·kg-1；其余各組小鼠每只每次背部皮下注射含50% CCl4的玉米油混懸液2 mL·kg-1，每隔3 d注射一次，持續(xù)12周，建模及給藥方法如Fig 1A所示。

于實驗第3周開始給予小鼠藥物治療10周，Silibinin組55 mg·kg-1·d-1、Apigenin-L組15 mg·kg-1·d-1、Apigenin-M組30 mg·kg-1·d-1、Apigenin-H組60 mg·kg-1·d-1，對照組和模型組給予相同體積的生理鹽水，灌胃給藥。期間觀察小鼠體重、運動、飲食及毛發(fā)等情況。(芹菜素與水飛薊賓同為黃酮類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)相似，Silibinin組與Apigenin-M組給藥的摩爾量一致)。

1.3 肝臟大體形態(tài)記錄及肝臟系數(shù)統(tǒng)計給藥結(jié)束后，所有小鼠稱重，并進行解剖取出肝臟，體式顯微鏡記錄各組小鼠肝組織大體形態(tài)并進行稱重，計算各組肝臟系數(shù)，根據(jù)對照組計算相對值，肝臟系數(shù)=肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.4 肝功能指標(biāo)相關(guān)指標(biāo)檢測實驗結(jié)束時，各組小鼠摘除眼球取血，室溫靜置30 min，低溫離心，取上清液，按照試劑盒說明書操作進行各組小鼠血清ALT、AST、ALB及TP含量測定。

1.5 肝組織的病理學(xué)檢測及免疫組化將肝組織進行固定和脫水后制作成石蠟組織切片，一部分切片使用蘇木精-伊紅(HE)和Masson染色評價各組肝組織的形態(tài)學(xué)變化及膠原纖維含量的變化。另一部分切片分別使用磷酸化AKT抗體和磷酸化PDK1抗體及相應(yīng)免疫組化二抗孵育，DAB顯色。病理切片評分規(guī)則：染色強度評分按照無染色、淺棕黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2、3分；染色面積評分按照1%～25%、25%～50%、50%～75%、>75%分別計1、2、3、4分；總評分為二者的乘積。

1.6 qRT-PCR檢測EMT標(biāo)志物基因表達水平取各組小鼠新鮮肝臟組織20 mg，液氮中研磨裂解，提取RNA并進行qRT-PCR，分別檢測E-cadherin基因CDH1、Vimentin基因Vim的mRNA水平。相關(guān)引物序列如下：CDH1上游引物序列為5′-TCATGAGTGTCCCCCGGTAT-3′，下游引物序列為5′-TCTTGAAGCGATTGCCCCAT-3′；Vim上游引物序列為5′-GGACCAGCTAACCAACGACA-3′，下游引物序列為5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′。

1.7 Western blot檢測小鼠肝臟組織中蛋白表達取適量肝臟組織充分裂解并收取總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜進行封閉。使用相應(yīng)抗體和二抗進行孵育，顯影拍照記錄并計算灰度值進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素改善CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠生活狀態(tài)、恢復(fù)小鼠體質(zhì)量建模期間對小鼠的一般生活狀態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)對照組小鼠反應(yīng)靈敏，食欲較好，皮毛順滑有光澤；模型組小鼠反應(yīng)遲鈍，萎靡不振，食欲較差，皮毛雜亂無光澤；芹菜素低、中、高各劑量組及水飛薊賓組小鼠反應(yīng)速度、食欲及毛發(fā)色澤均較模型組有所好轉(zhuǎn)，且芹菜素的藥效具有量效關(guān)系。實驗期間持續(xù)監(jiān)測各組小鼠的體質(zhì)量變化，結(jié)果顯示，對照組小鼠體質(zhì)量平緩上升，建模各組小鼠隨建模時間波動變化、整體上升，至實驗結(jié)束時，各組小鼠體質(zhì)量平均值由大到小依次為：對照組、芹菜素高劑量組、芹菜素中劑量組、水飛薊賓組、芹菜素低劑量組和模型組。與對照組相比，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯降低；與模型組相比，給藥的4組小鼠體質(zhì)量明顯升高；H組小鼠的體質(zhì)量改善明顯好于S組(Fig 1B)。

Fig 1 Modeling drug administration profile and body weight change of miceA：Model establishment and administration of mice in each group; B：The trend of body weight in each group.

2.2 芹菜素對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟形態(tài)、肝系數(shù)及肝功能的作用實驗結(jié)束解剖小鼠，將肝臟置于體視顯微鏡下觀察統(tǒng)計，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟顏色變淺變暗，表面粗糙有小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較韌，體積縮小。水飛薊賓和芹菜素均可以緩解模型小鼠肝臟病變，芹菜素的藥效具有量效關(guān)系且高劑量組效果好于水飛薊賓組(Fig 2A)。統(tǒng)計各組小鼠的肝系數(shù)并根據(jù)對照組計算相對值，結(jié)果顯示與對照組相比，模型組小鼠肝系數(shù)明顯高于對照組，水飛薊賓、芹菜素中劑量和高劑量組均可以明顯降低肝纖維化小鼠的肝系數(shù)，且高劑量芹菜素的效果好于水飛薊賓組(Fig 2B)。分別測定各組小鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST、ALB及TP的含量，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST水平升高，ALB、TP水平降低，顯示模型組建模成功；與模型組相比，芹菜素組和水飛薊賓組小鼠血清中ALT、AST水平降低，ALB、TP水平升高(Fig 2C)。

Fig 2 Morphology and liver coefficient levels of mouse liverA：Representative pictures of liver gross morphology in each group; B：Relative liver coefficient levels of mice in each 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group；*P<0.05, **P<0.01 vs Model group；△△P<0.01 vs Silibinin group.

2.3 芹菜素降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠肝臟組織病理損傷利用HE染色和Masson染色觀察小鼠肝組織病理學(xué)改變。對照組小鼠肝細胞呈放射狀排列，中央靜脈清晰，無壞死、炎癥及纖維化發(fā)生，病理學(xué)評分最低；模型組小鼠肝細胞小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝板排列紊亂，呈彌漫性改變。肝間質(zhì)可見明顯的脂肪變性、壞死，膠原沉積明顯，炎細胞浸潤。模型組肝纖維化程度明顯高于其他各組，病理學(xué)評分最高；與模型組相比，4個給藥組小鼠肝臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)病變均有明顯改善，假小葉較少，膠原沉積和炎細胞浸潤較少，病理學(xué)評分均低于模型組，且芹菜素給藥組的病理學(xué)評分隨劑量升高而降低，其中中劑量和高劑量芹菜素給藥組病理學(xué)評分顯著低于模型組(Fig 3A-D)。

Fig 3 Pathological lesion staining of mouse A-B：Representative images of HE staining in liver tissue sections and statistics of pathological score; C-D：Representative images of Masson staining and pathological score statistics of liver tissue sections. 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group；*P<0.05， **P<0.01 vs Model group.

2.4 芹菜素抑制肝細胞EMT前期研究顯示，芹菜素可以抑制肝癌細胞EMT，從而發(fā)揮抗癌作用。本研究利用各組小鼠肝臟組織進行qRT-PCR，分別檢測了EMT標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin蛋白的基因表達水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠肝臟中上皮表型標(biāo)志物E-cadherin基因CDH1表達水平明顯降低、間充質(zhì)表型標(biāo)志物Vimentin基因Vim表達水平明顯上高。芹菜素可以顯著抑制模型鼠肝臟細胞EMT，提高E-cadherin表達水平、降低Vimentin表達水平，且中、高劑量具有量效關(guān)系，結(jié)果如Fig 4A和4B所示。利用Western blot對各組小鼠肝臟組織中E-cadherin和Vimentin蛋白進行檢測，結(jié)果與qRT-PCR相似(Fig 4C)。

Fig 4 Effect of apigenin on EMT-related markers and signaling pathways in mouse A：Relative gene expression of E-cadherin; B：Relative gene expression of Vimentin; C：Expression levels of E-cadherin and Vimentin in liver tissues of mice in each group. 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group； **P<0.01 vs Model group.

2.5 芹菜素抑制PDK1/AKT信號通路PDK1和AKT磷酸化在EMT過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，也是引起肝纖維化的重要原因。本研究中，利用免疫組化評價了各組小鼠肝臟組織中磷酸化PDK(p-PDK S241)和磷酸化AKT(p-AKT S473)蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，肝纖維化小鼠肝臟組織中p-PDK和p-AKT表達水平明顯升高，芹菜素可以顯著抑制肝纖維化小鼠p-PDK和p-AKT表達，且中、高劑量具有量效關(guān)系(Fig 5A-D)。利用Western blot對各組小鼠肝臟組織中p-PDK S241和p-AKT S473蛋白進行檢測，結(jié)果與免疫組化相似(Fig 5E)。

Fig 5 Effect of apigenin on PDK1/AKT signaling pathway in mouse liver A-B：p-PDK1 S241 immunohistochemical representative images and pathological score statistics; C-D：p-Akt S473 immunohistochemical representative image and pathological scores statistics; E：Protein expression levels of p-PDK1 S241 and p-Akt S473 in liver tissues of mice in each group. 1：Control; 2:Model; 3:Silibinin; 4:Apigeniu-L; 5:Apigenin-M; 6:Apigenin-H. ##P<0.01 vs Control group； **P<0.01 vs Model group

3 討論

肝纖維化是指肝臟在各種致病因素作用之下，產(chǎn)生有活性的成纖維細胞，最終引起肝細胞外基質(zhì)彌漫性過度沉積的病理過程[13]。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，天然小分子在抑制、逆轉(zhuǎn)肝纖維化方面具有獨特優(yōu)勢，其中黃酮類小分子的藥效尤為顯著[14]。芹菜素是一種典型的黃酮類分子，本研究利用CCl4建立了小鼠肝纖維化模型，并評價了芹菜素對模型鼠的治療作用及藥理機制。

CCl4是一種具有肝臟毒性的有機溶劑，能夠引起肝細胞損傷、激活肝星狀細胞并增加細胞外基質(zhì)，從而引起肝纖維化。CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化病程穩(wěn)定，在病理學(xué)上與人肝纖維化具有很強的相似性[15]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有顯著的治療效果，能夠改善肝纖維化小鼠生活狀態(tài)、降低肝組織的病理損傷。

進一步的機制研究顯示，芹菜素通過PDK1/AKT信號通路抑制肝細胞EMT進而發(fā)揮藥效。間充質(zhì)細胞在肝纖維化形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，EMT過程使得具有上皮表型的細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型。EMT過程在肝纖維化進程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因此，抑制EMT對治療肝纖維化具有重要作用，也是目前肝纖維化治療領(lǐng)域研究的熱點問題。芹菜素具有抗炎、抗癌的作用，能夠通過抑制肝癌細胞EMT發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移、增殖的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素抑制了肝纖維化模型小鼠肝臟細胞Vimentin表達水平，同時提高了E-cadherin表達水平，Vimentin和E-cadherin蛋白分別為間充質(zhì)表型細胞標(biāo)志物和上皮表型細胞標(biāo)志物，該結(jié)果表明芹菜素在發(fā)生肝纖維化的肝臟細胞中抑制了EMT過程。PDK1/AKT信號通路與多個EMT相關(guān)蛋白關(guān)系密切，在發(fā)生EMT的細胞中，PDK1和AKT往往以磷酸化激活狀態(tài)存在[17]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素可以顯著抑制PDK1磷酸化水平和AKT磷酸化水平，通過抑制PDK1/AKT通路發(fā)揮抗纖維化的作用。

黃酮類分子富含于日常水果、蔬菜和多種野生植物之中，具有廣泛的藥理作用。在本研究中，將水飛薊賓作為陽性藥進行對比研究，該分子亦為黃酮分子。水飛薊賓能夠起到穩(wěn)定肝細胞膜、維持肝細胞完整的作用，在臨床上作為保肝、護肝，預(yù)防、治療肝纖維化的藥物使用。本研究結(jié)果顯示，芹菜素和水飛薊賓對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化均有治療作用，在相同摩爾濃度下，二者藥效相當(dāng)，進一步提高芹菜素的用藥劑量，藥效進一步提高且未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用。本研究初步闡釋了芹菜素的藥理機制，也進一步豐富了黃酮類分子的藥理作用，為研究黃酮類分子的共性藥理特征提供了信息。

肝纖維化導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)受到損傷，會導(dǎo)致肝硬化進而導(dǎo)致肝癌發(fā)生[18]。目前，肝硬化和肝癌暫時沒有有效的且能夠普及的治療方案，但是肝纖維化具有可逆性，治療肝纖維化為治療慢性肝病提供了有效的早期窗口，具有重要意義。盡管針對肝纖維化治療的藥物研究眾多，且取得較快發(fā)展，迄今為止，還沒FDA批準(zhǔn)的專門治療纖維化的藥物上市。針對病毒性肝炎，臨床上常使用干擾素和核苷酸類藥物阻止、延緩肝纖維化的進展，甚至可以達到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的效果。但其他病因的肝纖維化暫時缺乏有效的手段。

芹菜素來源于食物，安全性良好，具有潛在的應(yīng)用價值，擁有進一步開發(fā)為保肝、護肝，治療肝纖維化藥物的潛力。同時芹菜素在日常的水果、蔬菜中含量豐富，芹菜素新的藥效和藥理機制的發(fā)現(xiàn)，有助于指導(dǎo)人們通過日常飲食調(diào)節(jié)，達到預(yù)防肝病的保健作用。

本研究存在一定的不足，尚缺少在細胞水平、動物水平的深入機制研究，缺少對芹菜素毒副作用、藥物代謝動力學(xué)方面的系統(tǒng)研究。在未來的研究中，需對以上內(nèi)容進行補充研究。此外，還可針對芹菜素預(yù)防肝纖維化的效果開展研究。在藥物化學(xué)方面，可通過對芹菜素有針對性的改構(gòu)進一步增強其藥理活性。

綜上所述，芹菜素可以通過抑制PDK1/AKT信號通路來抑制肝細胞EMT，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。芹菜素具有進一步研發(fā)為保肝、護肝，治療肝纖維化的藥物的潛力。