人參皂苷Rg1通過AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬延緩小鼠腦衰老的研究

張 進， 王順和，汪 蘭， 胡 玲， 汪子鈴，曾 娣， 侯吉穎，黃彩虹， 杜坤航 ，王 璐， 王亞平

(重慶醫(yī)科大學 1.干細胞與組織工程研究室、2.病理學教研室、3.組織胚胎學教研室，重慶 400016)

目前，人口老年化趨勢日漸嚴峻，對于加快推動衰老生物學研究和尋找防治老年性疾病途徑已迫在眉睫。隨著年齡增加神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率不斷攀升，已經(jīng)嚴重危及老年人群的健康，目前還沒有延緩腦衰老的有效途徑。人參是中醫(yī)臨床“補氣”藥，我們既往研究證明[1-2]，人參皂苷Rg1是人參重要的抗衰老成分之一，它能有效延緩腦衰老，并證明可能與減輕神經(jīng)干細胞(NSCs)的氧化損傷密切相關，但其具體機制尚不清楚。最新研究表明[3-4]，自噬在調(diào)控細胞衰老過程發(fā)揮著極為重要的作用，而AMPK/mTOR信號通路在自噬相關的代謝中扮演著重要角色，因此，對于人參皂苷Rg1是否能通過調(diào)控該信號通路延緩腦衰老值得研究。本文采用D-半乳糖(D-gal)構建小鼠腦衰老模型，探討了人參皂苷Rg1延緩腦衰老與其調(diào)控自噬相關信號通路的機制，旨在為Rg1延緩腦衰老的臨床應用提供理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡♂ C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量(16～18)g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(渝)2018-0003。

1.2 主要藥品與試劑人參皂苷Rg1(成都曼思特生物科技有限公司，純度>99%)；D-半乳糖(D-gal，上海麥克林生化科技有限公司，純度>99%)；BCA蛋白濃度測定試劑盒 、RAPA裂解液(上海碧云天生物技術研究所)；兔單克隆抗體LC3-Ⅱ、p62、Beclin1、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR，鼠單克隆抗體p53(Affinity公司)，鼠單克隆抗體β-actin(Signaling公司)；乙酰膽堿酯酶試劑盒、雷帕霉素(Rapamycin)(索萊寶生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1腦衰老模型建立與分組處理 C57BL/6J雄性小鼠隨機分為4組(10只/組)。腦衰老模型組：腹腔連續(xù)注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal) (200 mg·kg-1·d-1×42 d)；對照組：腹腔注射等量生理鹽水×42 d；Rg1抗腦衰老模型組：腹腔注射等量D-gal×42 d，從d 16起，同時注射Rg1(40 mg·kg-1·d-1×27 d)； 自噬激活劑雷帕霉素抗衰老組：腹腔注射等量D-gal×42 d，從16 d起，同時注射Rap(2 mg·kg-1·d-1×27 d)，建模完成后于次日進行各實驗指標的檢測。

1.3.2小鼠衰老生物學表現(xiàn)觀察 在構建模型期間對各組小鼠進行衰老生物學動態(tài)觀察 ，包括體質(zhì)量、飲食、飲水情況、精神狀態(tài)、活動狀態(tài)、毛色與大小便等狀況。

1.3.3行為學測試 讓小鼠背對逃生平臺，將其分別從水迷宮的4個象限輕輕放入水槽之中，記錄小鼠在60 s內(nèi)找到逃生平臺的時間，并讓小鼠在逃生平臺上停留5 s，如果超過60 s仍未找到，則引導小鼠回到平臺并使其停留20 s。d 7，撤去逃生平臺，隨機將小鼠在任一象限的同一位置放入水槽之中，并記錄60 s內(nèi)小鼠在目標象限游泳的時間百分比與穿越原逃生平臺的次數(shù)。

1.3.4海馬組織形態(tài)學觀察 水迷宮測試完成后d 2，處死小鼠取腦組織，4%多聚甲醛固定2 d，選取腦海馬區(qū)制作石蠟切片，進行HE染色、Nissl染色，觀察各組海馬區(qū)神經(jīng)元損傷形態(tài)和神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體的數(shù)量，并用ImageJ軟件對海馬區(qū)神經(jīng)元進行計數(shù)分析。

1.3.5腦組織乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase ，AchE)活性測定 制備腦組織勻漿，8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。BCA蛋白測定試劑盒檢測各組上清液的蛋白濃度，按照AChE檢測試劑盒說明書相關檢測AChE活性并分析數(shù)據(jù)。

1.3.6腦組織自噬相關蛋白檢測 RAPA裂解液提取腦組織蛋白，BCA蛋白試劑盒進行蛋白濃度測定。SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜進行蛋白轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。兔抗LC3-Ⅱ(1 ∶1 000)、p62(1 ∶1 000)、Beclin1(1 ∶1 000)、鼠抗β-actin(1 ∶10 000)，4 ℃分別孵育過夜。次日，抗鼠二抗(1 ∶10 000)、抗兔二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光法顯影。用ImageJ軟件對各條帶進行其灰度值分析，并計算各目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的比值并作圖。同時用石蠟切片進行免疫組化染色，檢測海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)自噬蛋白p62、ATG5、ULK1的表達，并用ImageJ軟件對各組切片進行免疫組化定量分析并作圖。

1.3.7自噬通路AMPK/mTOR信號通路的檢測 對AMPK/mTOR信號通路的兩個主要蛋白進行Western blot蛋白檢測，包括p-AMPK/AMPK與p-mTOR/mTOR的比值。同時檢測腦組織中凋亡蛋白p53的表達，并用ImageJ軟件對各條帶進行灰度值分析并作圖。

2 結果

2.1 衰老模型小鼠逐漸表現(xiàn)出自然衰老的生物學特點隨著注射D-gal劑量累積和時間延長，D-gal組小鼠逐漸表現(xiàn)出衰老生物學特征，表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕，活動減少，精神倦怠，毛發(fā)灰暗，進食量減少，大便稀溏，符合自然衰老的生物學表現(xiàn)。而對照組和Rg1或Rap抗衰老組無明顯衰老的生物學表現(xiàn)。

2.2 Rg1能顯著改善腦衰老小鼠的空間探索與學習記憶能力水迷宮實驗結果表明，D-gal組小鼠在探索期的游泳軌跡雜亂無章，逃避潛伏期較長，并且在目標象限停留時間的百分比與穿越逃生平臺的次數(shù)均明顯低于對照組(P<0.05)，提示小鼠空間探索能力與學習記憶能力明顯降低，而用Rg1或Rap干預致衰老過程，小鼠空間探索能力與學習記憶能力明顯改善(Fig 1)。

Fig 1 Effect of ginsenoside Rg1 on learning and memory abilities of brain aging mice A： The effect of Rg1 on the escape latency of brain aging mice; B： The effect of Rg1 on the percentage of time that brain aging mice stayed in the target quadrant. *P<0.05 vs control；#P<0.05 vs D-gal. C： The effect of Rg1 on the number of times that brain aging mice crossed the platform. **P<0.01 vs control；##P<0.01 vs D-gal

2.3 Rg1對腦衰老小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與Nissl小體數(shù)量的影響HE染色結果表明，對照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列整齊，形態(tài)結構正常，而D-gal組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，排列紊亂，分布稀疏，且退變與壞死細胞數(shù)增多，Nissl染色顯示神經(jīng)元內(nèi)Nissl小體數(shù)量明顯減少。采用Rg1或Rap干預致衰過程，海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量無明顯減少，沒有明顯的形態(tài)學損傷，且神經(jīng)元內(nèi)Nissl數(shù)量無明顯減少(Fig 2，3)。

Fig 2 Effect of ginsenoside Rg1 on morphology andnumber of neurons in hippocampus of brain aging **P<0.01 vs control； #P<0.05，##P<0.01 vs D-gal

Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on number of Nissl bodies in hippocampus of brain aging mice(Nissl staining×400)

2.4 Rg1對腦衰老小鼠腦組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AhcE)活性的影響結果表明，D-gal組小鼠腦組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的活性明顯上升(P<0.05)，采用Rg1或Rap干預致衰過程，腦組織勻漿中乙酰膽堿酯酶的活性明顯降低(P<0.05)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of ginsenoside Rg1 on acetylcholinesterase in brain tissues of brainaging mice **P<0.01 vs control； #P<0.05，##P<0.01 vs D-gal

2.5 Rg1對腦衰老小鼠腦組織中自噬相關蛋白的影響Western blot結果表明，與對照組相比，D-gal組小鼠腦組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1表達下調(diào)，p62表達上調(diào)(P<0.05)，提示小鼠腦自噬活動的下降。采用Rg1或Rap干預致衰過程，LC3-Ⅱ、Beclin1表達上調(diào)，p62表達下調(diào)(P<0.05)，說明Rg1與Rap可以上調(diào)小鼠腦的自噬功能(Fig 5)。

Fig 5 Effect of ginsenoside Rg1 on expression of autophagy protein in brain tissues of brain aging mice A：Control B：D-gal C：Rg1+D-gal D：Rap+D-gal.*P<0.05，**P<0.01 vs control； #P<0.05，##P<0.01 vs D-gal

同時免疫組織化學染色結果表明，與對照組相比，D-gal組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)自噬相關蛋白p62表達上升，ATG5、ULK1蛋白表達下降(P<0.05)。采用Rg1或Rap干預致衰過程，p62表達下降，ATG5、ULK1蛋白表達明顯上升(P<0.05)，提示了Rg1與Rap可以上調(diào)海馬區(qū)神經(jīng)元的自噬功能(Fig 6)。

Fig 6 Effect of ginsenoside Rg1 on expression of neuronal autophagy protein in hippocampus of brain aging mice (Immunohistochemistry×400) *P<0.05 vs control，**P<0.01 vs D-gal ； #P<0.05，##P<0.01 vs D-gal

2.6 Rg1對腦衰老小鼠腦組織AMPK/mTOR信號通路以及p53蛋白的影響Western blot結果表明，D-gal組小鼠腦組織蛋白的p-AMPK/AMPK比值下降，p-mTOR/mTOR的比值上升，提示腦內(nèi)細胞自噬活動的下降。當采用Rg1或Rap干預致衰過程，腦組織蛋白的p-AMPK/AMPK比值上升，p-mTOR/mTOR的比值下降，說明Rg1可以通過上調(diào)p-AMPK或下調(diào)p-mTOR含量促進小鼠腦的自噬功能。同時，與對照組相比，D-gal組p53蛋白明顯上調(diào)(P<0.05)，提示小鼠腦中存在細胞凋亡現(xiàn)象，而采用Rg1或Rap干預致衰過程，p53表達明顯下降(P<0.05)，提示Rg1可以顯著拮抗D-gal所致的腦衰老(Fig 7)。

Fig 7 Effect of ginsenoside Rg1 on AMPK/mTOR signaling pathway and p53 protein in brain tissues of brain aging mice A：Control B：D-gal C：Rg1+D-gal D：Rap+D-gal. *P<0.05 ，**P<0.01 vs control； #P<0.05，##P<0.01 vs D-gal

3 討論

隨著年齡的增長，大腦逐漸出現(xiàn)器官與細胞水平上的退行性變，因此，阿爾茨海默病、帕金森病(PD)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率逐漸上升[5]。人參是中醫(yī)臨床“補氣”藥，而人參皂苷Rg1是人參中最重要的抗氧化、抗衰老成分，它能夠有效延緩機體腦器官的衰老[6]，本文采用D-gal構建腦衰老模型，旨在探討人參皂苷Rg1延緩D-gal所致的腦衰老與激活AMPK/mTOR信號通路調(diào)控自噬的初步機制。

D-gal是一種公認的致衰劑，所致衰老與自然衰老相似，它可以有效導致機體腦，心臟，脾等多個器官的氧化損傷與衰老，現(xiàn)被廣泛用于機體抗衰老機制的相關研究[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，D-gal對腦確有明顯損傷，并與其下調(diào)自噬活動有關[9]，而Rap是一種典型的自噬激活劑，它可以顯著提升機體的自噬功能[10]。本實驗結果證明，隨著注射D-gal劑量的累積和時間的延長，小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，毛色灰暗等與自然衰老相似的生物學特征。經(jīng)過水迷宮實驗測試小鼠的學習與記憶能力，D-gal組小鼠的空間學習與記憶能力明顯下降。在Rg1與Rap干預衰老模型之后，小鼠的學習與記憶能力顯著提高，并明顯提高了小鼠的認知功能，水迷宮實驗證明了Rg1與Rap確實可以改善D-gal對小鼠大腦所致的學習記憶能力的損傷。

自噬是一種調(diào)節(jié)機體吞噬自身衰老細胞與細胞器的活動，在一定程度上，上調(diào)自噬功能可以對機體起著抗衰老的作用[11]。Beclin1 是自噬過程啟動的關鍵因子[12]，當機體自噬啟動時，胞質(zhì)型LC3(LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽，轉變?yōu)樽允审w(膜型)，即LC3-Ⅱ。p62蛋白是自噬過程的一種降解產(chǎn)物，具有底物特異性，在自噬的中晚期被降解，因此組織整體的p62水平與自噬活動存負相關[13]。因此，LC3-Ⅱ、p62、Beclin1均可作為自噬水平檢測的主要標志物。本實驗研究結果表明，D-gal所致腦衰老小鼠LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白含量降低，p62蛋白含量升高。用Rg1與Rap干預其衰老進程之后，小鼠LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白含量升高，p62蛋白含量顯著降低，提示Rgl明顯改善了小鼠腦的自噬功能。AMPK/mTOR信號通路是細胞自噬的重要調(diào)控通路。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是調(diào)控自噬的重要信號分子[14]，自噬可在不同應激刺激下發(fā)生，如饑餓、缺氧和氧化應激[15]。在AMPK/mTOR信號通路中，AMPK通過磷酸化被激活，并降低了mTOR的磷酸化水平，最終激活自噬。Rg1與 Rap通過促進AMPK或抑制mTOR的磷酸化和調(diào)節(jié)各自噬相關蛋白的表達來調(diào)控自噬功能。據(jù)報道，有許多信號通路都參與了自噬的調(diào)控，包括AMPK、mTOR、PI3K與MAPK等信號通路，人參皂苷Rg1被認為通過AMPK/mTOR信號通路誘導自噬，自噬功能的下降則會導致衰老的發(fā)生[16]。本研究結果表明，D-gal組p-AMPK/AMPK明顯下降，p-mTOR/mTOR上升，通過Rg1與Rap干預之后，自噬活動明顯提升，此研究證明了Rg1可以通過AMPK/mTOR信號通路提升小鼠腦的自噬功能。乙酰膽堿是一種神經(jīng)遞質(zhì)，能特異性地作用于各類膽堿受體，在腦組織內(nèi)迅速被乙酰膽堿酯酶所分解[17]，因此,同時通過測定腦組織內(nèi)的乙酰膽堿酯酶活性可以反映神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的含量，以助于診斷小鼠大腦的神經(jīng)功能狀態(tài)。本研究結果表明，D-gal所致腦衰老小鼠的乙酰膽堿酯酶活性明顯升高，而Rg1與Rap干預之后可以顯著降低乙酰膽堿酯酶的活性，證明了Rg1可以改善D-gal所致小鼠腦衰老的神經(jīng)功能障礙。

綜上所述，本文通過腹腔注射D-gal成功構建小鼠腦衰老模型，同時用人參皂苷Rg1與自噬激活劑Rap干預其衰老機制，結果表明了Rg1確實可以延緩D-gal所致的腦衰老，與其自噬活動密切相關，并可能是因為上調(diào)了AMPK/mTOR信號通路，從而起著抗衰老的作用，這為今后進一步研究人參皂苷Rg1延緩機體衰老的具體機制提供了一定的理論基礎。