納米藥物在肝纖維化上的研究進展

陳重慶，查正寶，王 華

(1. 安徽醫(yī)科大學藥學院，安徽 合肥 230032；2.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，安徽 合肥 230031；4.安徽醫(yī)科大學炎癥免疫性疾病安徽省實驗室，安徽 合肥 230032)

肝纖維化是一個對分子、細胞和組織進行高度整合的動態(tài)的過程，其主要特征表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的過量積累[1]。在臨床上至今尚未開發(fā)出特異性逆轉或阻止肝纖維化進展的藥物。

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)最早是由Carl von Kupffer于1876年發(fā)現(xiàn)，其主要分布在肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞之間的Disse間隙，約占所有常駐肝細胞的10%，HSCs最獨特的特征是在細胞質(zhì)內(nèi)有含有大量的維生素A和甘油三酯的脂滴[2]。在正常肝臟中，HSCs會保持一種非增殖、靜止的表型，而當肝損傷后，肝細胞發(fā)生凋亡或壞死，隨之釋放促炎細胞因子和促纖維化細胞因子，刺激炎癥細胞在肝臟中募集和激活，此時的HSCs被激活，從儲存維生素A的細胞轉變?yōu)榧〕衫w維細胞，并具有增殖、收縮、趨化功能，進而產(chǎn)生過量的ECM成分，積聚在肝實質(zhì)細胞中，破壞肝臟結構，形成特有的瘢痕組織[3]。目前的研究表明，HSCs激活增殖是肝纖維化中的一個重要事件， 抑制HSCs激活是促進肝纖維化逆轉的關鍵[4]。

隨著納米給藥技術的進步和應用，專注于治療肝纖維化的納米藥物與日俱增，根據(jù)納米粒子的天然特性，一般可分為無機納米粒子和有機納米粒子[5]。納米粒子體積很小，可以在人體內(nèi)更自由地移動，通過靜脈注射，甚至可以實現(xiàn)從胞質(zhì)遞送到單個靶細胞。因此，研究使用納米技術將治療藥物靶向輸送至肝臟病灶部位，從而治療肝纖維化將具有很好的前景[6]。近些年對納米藥物的開發(fā)多集中于靶向肝臟纖維化組織區(qū)域的局部藥物遞送，而關于如何實現(xiàn)靶向給藥，目前主要采用兩種策略，一種是優(yōu)化納米粒子的物理化學性質(zhì)，如表面電荷、形狀和尺寸，另一種方法是在納米粒子表面修飾上靶細胞能夠識別的化學官能團[7]，具有多種特異性過表達受體類型的HSCs是主要研究的靶點[6]。本文對近幾年研究的作用于HSCs上的無機納米藥物和有機納米藥物進行了總結，綜述了目前納米藥物在抑制HSCs激活進而治療肝纖維化的一些應用研究，相關納米藥物實例見Fig 1。

Fig 1 Nano-drugs acting on hepatic stellate cells to treat liver fibrosis

1 無機納米藥物

在治療肝纖維化研究中根據(jù)材料屬性的不同，可以將無機納米粒子分為金、磁性氧化鐵納米顆粒等金屬類材料以及二氧化鈦、二氧化硅納米顆粒等非金屬類材料。無機納米藥物依賴其獨特的材料和結構所賦予的物理化學性質(zhì)而引起了廣泛關注，這是有機納米藥物所不可能實現(xiàn)的[5]。

1.1 金屬類無機納米藥物有絲分裂原血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及其受體-β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)在HSCs活化中起著重要的作用，有可能作為抗纖維化治療的新靶點[8]。金納米顆粒(gold-based nanoparticle，GNP) 具有高電子密度、催化作用、介電特性等優(yōu)點，可以被動地在肝臟積累，在肝臟疾病的治療上具有巨大的潛力；此外，GNP具有光熱特性，通過對特定的細胞輸送，可以誘導局部近紅外光介導的熱消融促使細胞失活[9]。Ribera等[9]設計了一種包被PDGFR-β的金納米棒，簡稱GNR-PDGFR-β，其以激活的HSs為靶點，通過選擇性光熱消融致使HSCs失活，減輕了在四氯化碳造模誘導的小鼠肝纖維化、炎癥和肝細胞損傷。GNR-PDGFR-β這種新型納米材料介導的光熱療法不同于傳統(tǒng)的藥物治療，它可以有效地將光能轉化為熱能，在激活的HSCs積聚并誘導其死亡，最大限度地減少對周圍組織的損傷，這是在肝纖維化領域的一項重大創(chuàng)新。

有研究表明成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)在纖維化相關疾病中起到抗纖維化的作用，并且能促進組織再生。FGF2主要同成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1，F(xiàn)GFR1)相互作用，在活化的HSCs中高表達，并抑制其激活[10]。Kurniawan等[10]通過碳二亞胺化學偶聯(lián)的方法將FGF2偶聯(lián)到超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)上。在四氯化碳誘導的小鼠早期肝纖維化模型中，通過靜脈給藥FGF2-SPIONs，發(fā)現(xiàn)HSCs激活的標志物α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和結蛋白的表達顯著降低，F(xiàn)GF2-SPIONs明顯抑制了HSCs的激活、遷移、收縮以及膠原的產(chǎn)生。FGF2-SPIONs這種超順磁性氧化鐵納米顆粒使FGF2的穩(wěn)定性增加，改善了FGF2在肝臟的蓄積，同時提高了其對HSCs的靶向性，這是第一個嘗試向患病肝臟遞送FGF2的研究，該納米給藥系統(tǒng)值得在更多的肝纖維化模型中進一步探索。

1.2 非金屬類無機納米藥物二氧化鈰納米顆粒(cerium dioxide nanoparticles，CeO2NPs)已被證明具有清除自由基清除和抗炎的作用[11]。然而，CeO2NPs對肝臟疾病是否有治療價值尚不清楚。Oró等[11]發(fā)現(xiàn)在四氯化碳造模的肝纖維化大鼠模型中，靜脈注射CeO2NPs，通過全身成像發(fā)現(xiàn)其主要分布于肝臟，且與模型組小鼠相比可明顯減輕肝臟脂肪變性和門靜脈高壓，降低大多數(shù)炎癥因子的表達，HSCs活化的標志物α-SMA的表達也顯著降低。這說明CeO2NPs對慢性肝病的治療有一定的研究價值。

二氧化鈦納米顆粒(titanium dioxide nanoparticles， TiO2NPs)和二氧化硅納米顆粒(silica nanoparticles，SiO2NPs)近年來被用作一種活性抑制劑，因為它們特殊的物理化學性質(zhì)，可以靶向HSCs來阻止纖維化及其相關表型的表達[12]。Peng等[12]研究了不同粒徑的TiO2NPs以及SiO2NPs對HSCs激活模型LX-2細胞增殖、黏附和遷移的影響，實驗發(fā)現(xiàn)，使用TiO2NPs、SiO2NPs之后由轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)激活的HSCs產(chǎn)生的纖維化標志物如I型膠原(type I collagen，COL-I)、α-SMA的基因和蛋白表達的生化指標均降低，即使在很低的濃度下，這些纖維化標志物的表達也沒有恢復到其激活水平，這提示了TiO2NPs、SiO2NPs具有持續(xù)的效應，而這可能因為它們能在細胞內(nèi)持續(xù)累積攝取。此外，通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉化基因(epithelial-mesenchymal transition，EMT)可以進一步抑制TGF-β激活的LX-2細胞在納米材料處理下的黏附和遷移特性，使其恢復到更安靜的狀態(tài)?？偠灾?，這些實驗為TiO2NPs、SiO2NPs作為治療體內(nèi)纖維化的潛在治療抑制劑提供了證據(jù)。

2 有機納米藥物

有機納米藥物可以描述為由有機化合物(包括聚合物納米粒子、脂質(zhì)體、脂質(zhì)納米粒、聚合物膠束等)組成的藥物載體系統(tǒng)。除了具有良好的生物相容性，這些納米顆粒還可以包裹和保護活性化合物，使其免受低pH環(huán)境或胃腸道酶降解的影響[13]。

2.1 聚合物納米粒子納米粒通常被定義為粒徑在1～100 nm之間的粒子，許多高分子聚合物可用于制備納米粒。聚合物納米粒子(polymer nanoparticles，PNPs)具有可以減少毒副作用、保護藥物不在體內(nèi)被降解、提高患者依從性以及達到更有利的藥物藥代動力學等特點[14]，在對其表面進行修飾后，可以實現(xiàn)肝纖維化的靶向治療。

索拉非尼(sorafenib，SOR)是FDA批準的一種治療晚期肝癌的化學藥物，最近有報道其可以通過抑制HSCs的增殖來減輕肝纖維化。然而，SOR不溶于水，使得其生物利用度低，嚴重影響其治療效果[15]。miR-155是一種典型的多功能微小RNA(microRNA，miRNA)，在炎癥過程中發(fā)揮關鍵作用，可以將抗炎的M2巨噬細胞表型極化為促炎的M1巨噬細胞表型[16]。Wu等[17]開發(fā)了一種新型的含氟聚合物FP2M/PBA，以氟化鏈作為橋梁來交聯(lián)陽離子組分，形成氟化鏈分布在聚合物主鏈上的聚合物納米粒子，并且通過負載高載藥量的SOR和miR-155抑制劑制備成一種新型納米顆粒。研究者發(fā)現(xiàn)miR-155與促炎反應或HSCs增殖相關的靶基因存在一定的聯(lián)系，這種聚合物納米粒子通過SOR聯(lián)合抗miR-155基因治療，將庫普弗細胞(kupffer cells，KCs)從促炎的M1表型極化為抗炎的M2表型，同時通過抑制HSCs增殖來間接影響HSCs的激活。這種通過對KCs和HSCs的雙重調(diào)控來提高療效和預防肝纖維化復發(fā)的方法將會是未來治療肝纖維化的一條新思路。

吉馬酮(germacrone，GMO)是中藥姜黃中的主要活性成分之一。主要成分是GMO的復方鱉甲軟肝丸已被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準為第一個抗纖維化藥物[18]。最近有報道，miR-29b家族在HSCs活化和肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中顯著下調(diào)，因此通過恢復細胞內(nèi)miR-29b的水平，可以從多個水平抑制肝纖維化信號轉導和ECM蛋白的表達，進而可能減輕肝纖維化[19]。De等[19]首次以聚乙二醇-嵌段-聚丙交酯-乙交酯((ethylene glycol)-block-poly(lactide-co-glycolide)，PEG-PLGA)為載體，將GMO和miR-29b共包裹成納米粒子，然后用環(huán)狀RGD肽(cyclic RGD peptides，cRGDfK)修飾納米顆粒，形成G/R-RGD-NPs。整合素屬于異源二聚體細胞表面受體大家族，可以調(diào)節(jié)細胞黏附并對細胞外基質(zhì)作出反應[20]。cRGDfK是結合整合素αvβ3，增強肝纖維化靶向性的有效配體，cRGDfK修飾的負載GMO和miR-29b的聚合物納米粒子對活化的HSCs有很強的細胞毒作用，并顯著抑制COL-I的產(chǎn)生，并且G/R-RGD-NPs與游離GMO相比對肝纖維化小鼠具有更強的靶向性，其可能成為一種新的、有效的治療肝纖維化的臨床選擇。

2.2 脂質(zhì)體脂質(zhì)體具有雙層膜結構，可以同時包封疏水性藥物和親水性藥物，其中疏水性藥物納入雙層膜中，親水性藥物被包裹在脂質(zhì)膜形成的水核中。脂質(zhì)體具備高生物相容性、高生物降解性、低免疫原性、延長藥物半衰期、降低毒副作用等優(yōu)點，是很好的藥物載體[21]。

維莫德吉(vismodegib，VIS)是一種Hedgehog(Hh)抑制劑，最初被用來治療肝癌，已經(jīng)被證明通過抑制HSCs活化來減輕肝纖維化[22]。然而，VIS的一些不良特性，如水不溶性、半衰期短以及對正常細胞和非HSCs的毒副作用，限制了其治療效果[23]。因此，需要一種新的策略來提高VIS療效并減少其副作用。Li等[20]建立了一個空間穩(wěn)定的脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體含有與整合素αvβ3具有高親和力的環(huán)肽(cyclo [Arg-Gly-Asp-Dtyr-Lys]，cRGDyK)，實驗發(fā)現(xiàn) cRGDyK引導的脂質(zhì)體(cRGDyK-guided liposome，RGD-Lip)，在體內(nèi)能被激活的HSCs優(yōu)先內(nèi)化，在激活的HSCs中，RGD-Lip熒光定位與αvβ3大部分重疊，而當使用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)敲除αv或β3之后大大降低了對RGD-Lip的攝取，這表明激活的HSCs對RGD-Lip的攝取是由整合素αvβ3介導的。實驗發(fā)現(xiàn)RGD-Lip對激活的HSCs比靜止的HSCs表現(xiàn)出很高的選擇性，并且會優(yōu)先在纖維化的肝臟中積累，當負載VIS時，RGD-Lip特異性地抑制激活的HSCs中Hh通路信號的表達，在體內(nèi)和體外均顯示出良好的抑制HSCs活性的作用。并且除了VIS，RGD-Lip還可以用于向激活的HSCs輸送其他治療藥物或基因，這顯示了該納米系統(tǒng)為未來在治療肝纖維化上有巨大的潛力。

吡非尼酮(pirfenidone，PF)是一種經(jīng)美國食品和藥物管理局批準用于特發(fā)性肺纖維化的新型抗纖維化藥。但是如果口服給藥，會引起嚴重的胃腸道副作用。而且，單獨使用PF沒有靶向性。因此需要一種新的給藥系統(tǒng)來減少其副作用，增強靶向性。AMD3100是一種C-X-C趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4)的拮抗劑，已被美國食品和藥物管理局和歐洲藥品管理局批準可在臨床上用于淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤疾病的治療。有研究表明CXCR4是基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1，SDF-1)特異性受體，在肝纖維化小鼠模型，抑制激活的HSCs中SDF-1α/CXCR4軸可能是治療肝纖維化的一條潛在選擇[24]。Ullah等[24]采用薄膜水合法將PF和AMD3100共包裹在CXCR4靶向復合脂質(zhì)體(CXCR4 targeted combination liposome，CTC-Lip)中。在體外實驗中，與游離的PF、AMD3100相比，CTC-Lip提高了細胞存活率，降低了藥物的毒性，并且CTC-Lip促使TGF-β誘導活化的HSCs凋亡，同時可阻斷SDF-1α/CXCR4軸的上調(diào)，顯著降低α-SMA、CXCR4、TGF-β的表達。總之，采用CTC-Lip的聯(lián)合用藥可以成為治療肝纖維化一種新的策略。

2.3 脂質(zhì)納米粒脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles，LNPs)，是構成脂質(zhì)體的磷脂囊泡，由脂質(zhì)雙層組成，具有中空結構。LNPs可以提高藥物的吸收和生物利用度，它們可以跨過血腦屏障， 延長在體內(nèi)循環(huán)時間，其所采用的脂類可以將藥物載體的細胞毒性降至最低，并且整個納米藥物載體提高了藥物的穩(wěn)定性和承載力， 阻止藥物的滲漏[25]。

松弛素(relaxin，RLN)是一種抗纖維化多肽激素，先前的研究認為其可以直接逆轉HSCs的激活，從而緩解肝纖維化。松弛素受體主要由KCs表達，在與松弛素結合后，KCs從促纖維化發(fā)生表型轉變?yōu)槔w維化溶解表型，后者可以通過miR-30a-5p釋放外泌體，一旦被激活的HSCs攝取，它就以凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)為靶點，并且可以克服過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)的缺乏，PPAR-γ是由促纖維原活化引起的，通過上調(diào)PPAR-γ表達，最終使激活的HSCs對RLN介導的失活敏感，促使激活HSCs恢復靜止狀態(tài)[26]。在這些實驗的基礎上，Hu等[26]開發(fā)了一種包裹RLN基因和miR-30a-5p模擬物的脂質(zhì)納米顆粒，它會優(yōu)先靶向纖維化肝臟中激活的HSCs，進而治療肝纖維化。實驗證明了miR-30a-5p對激活的HSCs的靶向遞送與RLN基因治療具有協(xié)同作用，并且靶向RLN基因治療肝纖維化是一種高效、安全、多功能的新方式，在未來的臨床應用中很有前景。

高遷移率族蛋白-1(high mobility group protein-1，HMGB1)是一種促炎細胞因子和成纖維細胞趨化因子，可促進HSCs增殖。siRNA也在臨床試驗中證明了其有基因沉默的潛力，但是需要一種合適的藥物載體完成siRNA在細胞內(nèi)的遞送，減少它的酶降解和快速清除[27]。Zhang等[27]制備了pPB肽(C*SRNLIDC*)修飾的HMGB1-siRNA負載穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)納米粒(HMGB1-siRNA@SNALP-pPB)。本實驗發(fā)現(xiàn)HMGB1-siRNA@SNALP-pPB在pPB肽的介導下能特異性靶向HSCs，沉默HMGB1基因的表達，抑制HMGB1蛋白的激活和增殖，同時也抑制多種炎癥因子的表達以及肝組織膠原沉積，并且在硫代乙酰胺以及四氯化碳誘導的肝纖維化模型中能顯著延長小鼠的存活時間。這種具有抗纖維化和抗炎的雙重效果的脂質(zhì)納米粒為今后肝纖維化治療策略的制定提供了有價值的思路和科學的依據(jù)。

2.4 聚合物膠束聚合物膠束(polymeric micelles，PMs)是一種自組裝的膠體粒子，具有親水性頭部和疏水性尾部，由于其在生物體系中能達到超過臨界膠束濃度的特性，大大提高了藥物的溶解性、滲透性和生物利用度[28]。

CD44作為一種介導細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)黏附的黏附因子，在活化的HSCs和各種腫瘤細胞上特異性地過表達。與CD44特異相互作用的天然底物包括透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)和硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)。CS作為細胞外基質(zhì)的一部分，是一種線性多糖，具有較好的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等特點[29]。Luo等[29]在實驗中先合成硫酸軟骨素納米膠束-脫氧膽酸偶合物(chondroitin sulfate deoxycholic acid conjugate，CS-DOCA)，之后將維甲酸(retinoic acid，RA)和阿霉素(doxorubicin，DOX)包埋在CS膠束中，形成DOX + RA-CS膠束共給藥載體。在四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化模型中，尾靜脈注射DOX + RA-CS膠束后發(fā)現(xiàn)CS膠束可以通過CD44受體介導的內(nèi)化途徑發(fā)生內(nèi)吞，選擇性積聚在CD44高表達的激活的HSCs中，之后通過高爾基體介導的N-乙酰半乳糖胺轉移酶(golgi mediated by N-Acetylgalac-tosaminyl transferase，GalNAc-T)，CS膠束選擇性靶向激活的HSCs的高爾基體。其中RA可以破壞激活的HSCs的高爾基體結構、抑制膠原合成，而小劑量的DOX可以通過破壞DNA功能誘導激活的HSCs死亡。這說明表明DOX + RA-CS膠束共給藥系統(tǒng)是一種非常有前途的抗肝纖維化的靶向藥物。

有意思的是，納米藥物在運送到靶部位的過程中也存在一定的困難。與肝纖維化相關的纖維化膠原(主要是COL-I)在Disse間隙的過度沉積會明顯阻礙納米制劑向HSCs的輸送[30]。Fan等[30]以聚(乳酸-乙醇酸)-b-聚乙二醇-馬來酰亞胺(poly-(lactic-coglycolic)-b-poly(ethylene glycol)-maleimide，PLGA-PEG-Mal)為基礎，制備了一種膠原酶I和維生素A共同修飾的聚合物膠束，其具有納米鉆孔形態(tài)，并且能夠靶向HSCs，簡稱CRM。在纖維化的肝臟中，修飾CRM的I型膠原酶可以促進其對纖維化ECM的滲透，而CRM表面修飾的維生素A可以使其可以有效地被識別并靶向HSCs。當遇到I型膠原蛋白屏障時，CRM發(fā)揮了類似于納米鉆探的功能，有效地降解了細胞周圍的I型膠原蛋白。在體外實驗發(fā)現(xiàn)與其他膠束制劑相比其更容易被LX-2細胞攝取的能力，同時在小鼠肝纖維化模型中，CRM也可以實現(xiàn)在肝纖維化組織中的良好蓄積以及精確靶向激活的HSCs。此外CRM在體外具有良好的細胞相容性和血液相容性，在體內(nèi)也沒有急性或慢性毒性。這些研究提示CRM是一種理想的HSCs靶向納米給藥系統(tǒng)，I型膠原酶修飾有望成為構建更高效的HSCs靶向納米給藥系統(tǒng)的新策略。

3 小結

肝纖維化是機體在各種病因下所致肝損傷后的創(chuàng)傷愈合反應，損傷部位被大量的ECM所包圍，而HSCs是ECM產(chǎn)生的主要來源，其在肝纖維化的發(fā)展過程中占據(jù)著舉足輕重的地位。傳統(tǒng)的抗纖維化藥物如SOR、VIS、PF等存在溶解度低、無特異性靶向、會造成一定的不良反應等問題，大大降低了其在體內(nèi)的治療效率。本文提到的無機納米藥物和有機納米藥物具有良好的可修飾性、靶向性，在治療纖維化的研究中具有廣闊的應用前景。然而，目前對納米藥物的研究還處在臨床研究階段，納米藥物的降解產(chǎn)物存在著一定的毒性， 其代謝產(chǎn)物的副作用暫時也無法徹底地消除；并且納米藥物在到達肝臟后，機體酶會使其在肝臟內(nèi)變得極不穩(wěn)定，很容易產(chǎn)生一系列排斥反應。因此對納米藥物的功能進行進一步優(yōu)化，改善其生物相容性，降低免疫排斥反應和毒性作用將會是未來治療肝纖維化藥物研究的重點。