溫度響應性納米凝膠的制備及相轉(zhuǎn)變機理探究

陳偉，李雪婷，2，魯希華，2

(1.東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620；2.安徽美科迪智能微膠囊科技有限公司，安徽 銅陵 244000)

環(huán)境刺激響應性納米凝膠可以根據(jù)外界刺激(如溫度、pH等) 可逆地改變其溶解性、形狀和構象[1-3]。其中，具有溫度響應性的功能單體N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)[4-5]，由于其均聚物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)的相變溫度(Tp)接近人體生理溫度，且高度可調(diào)，NIPAM被選為用于構造各種智能凝膠的基本功能單體[6-7]。

本文嘗試合成與NIPAM 結構類似的丙烯酰胺單體，通過與NIPAM簡單的共聚，制備溫敏性共聚納米凝膠。探究了單體配比、SDS用量和BIS含量對共聚納米凝膠粒徑、分散性的影響。利用變溫紅外光譜表征了納米凝膠的相變行為，最后探究了納米凝膠的生物相容性，證明其具有良好的生物醫(yī)學應用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

環(huán)己胺、丙烯酰氯、二氯甲烷(DCM)、三乙胺、氫氧化鈉、鹽酸、N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS)、過硫酸銨(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)均為分析純；透析袋MWCO(800～1 400 Da)；超純水；小鼠上皮成纖維細胞(L-929)，中科院上海細胞庫；DMEM/F12培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胎牛血清，美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司；活細胞/死細胞雙染試劑盒(Calcein AM/PI)，美國 Hyclone 公司。

BI-200SM動態(tài)激光光散射儀； JEM-2100透射電鏡；Nicolet Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀；Avance 3hd 600 MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀； Countstar細胞計數(shù)儀；Heraeus BB15型CO2細胞培養(yǎng)箱。

1.2 CHAA的合成[8]

將環(huán)己胺1.98 g(20 mmol)裝在50 mL圓底燒瓶中，并溶于無水二氯甲烷(25 mL)中。冷卻至 0 ℃(冰/水)，加入無水三乙胺2.12 g(21 mmol)、丙烯酰氯溶液(1.90 g丙烯酰氯溶于5 mL無水二氯甲烷)中，在4 ℃下攪拌3 h。加熱至室溫，用 1 mol/L 鹽酸溶液(30 mL)淬滅。萃取有機相，用 1 mol/L 氫氧化鈉(30 mL)和鹽水(30 mL)洗滌，用Na2SO4干燥，濃縮，得到橙色油狀物質(zhì)。通過硅膠柱色譜法(正己烷∶乙酸乙酯=5∶1) 洗脫，得到白色固體2.45 g，產(chǎn)率80%。

1.3 納米凝膠的制備

通過乳液沉淀聚合法合成PNCH納米凝膠(圖1)[9]。

圖1 P(NIPAM-co-CHAA)共聚納米凝膠的合成示意圖Fig.1 Synthesis of P(NIPAM-co-CHAA) copolymer nanogels

將共聚單體(NIPAM，CHAA)和BIS、SDS(0.05 g，2 mmol)溶于100 mL超純水中。進料中的總單體為10 mmol/L，而共聚單體的摩爾比(NIPAM/PEAA/BIS=(100-x)∶x∶2根據(jù)所需的CHAA含量而變化。在70 ℃的氮氣保護下，使用APS引發(fā)聚合4 h。冷卻，用去離子水透析1周，每天更換透析水3次。根據(jù)CHAA占進料中總單體含量的比例，所得的PNCH納米凝膠分別表示為PNCH3、PNCH5、PNCH7、PNCH10、PNCH13和PNCH16。具體配比見表1。

表1 不同單體配比P(NIPAM-co-CHAA) 納米凝膠的制備配方Table 1 Preparation formula of P(NIPAM-co-CHAA) nanogels with different monomer ratios

1.4 單體和凝膠結構表征

1.4.1 單體的1H NMR 稱取10 mg樣品，置于 5 mm NMR 專用樣品管中，用0.5 mL重水溶解后測試。

1.4.2 單體的紅外光譜 采用KBr 壓片法。樣品研磨成粉末，用量1～2 mg。在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，掃描次數(shù)為16 次，分辨率為4 cm-1。

1.4.3 DLS表征 使用動態(tài)激光光散射儀測量納米凝膠的粒徑和粒徑分布。激光波長為 532 nm，散射角度為90°，測試溫度為5 ℃；變溫測試時溫度為5～44 ℃，以3 ℃為增量。

1.4.4 變溫紅外(FTIR) 表征 將冷凍干燥后的納米凝膠固體溶于D2O (10%)，在4 ℃ 環(huán)境內(nèi)溶脹1周。將凝膠密封在兩個CaF2窗片之間，用變溫FTIR 測量。不同溫度下的FTIR光譜均以 4 cm-1為分辨率記錄在紅外光譜儀上，進行10 次掃描，以得到可接受的信噪比。在20～40 ℃ 之間以 1 ℃ 為增量，收集隨溫度變化的光譜。

1.5 體外細胞實驗

取100 mg 納米凝膠干粉浸泡在10 mL完全培養(yǎng)基中24 h，無菌過濾后制成浸提液。48 孔板中每孔添加2×104細胞，培養(yǎng)24 h，形成細胞半融合層。每孔再添加800 μL 各組浸提液，培養(yǎng)24 h。在每孔中加入400 μL CCK-8 檢測液，在37 ℃ 的培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用酶標儀測定450 nm 處的吸光值，進而判斷細胞的數(shù)量。

使用AM/PI 細胞染料對培養(yǎng)的細胞進行染色，材料的制備與上述實驗一致，對處理好的材料上每孔種植1.0×105小鼠上皮成纖維細胞(L-929)，置于濃度5% 的CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，溫度37 ℃。取樣進行活死染料染色，置于倒置熒光顯微鏡下，觀察細胞的存活狀態(tài)。

2 結果與討論

2.1 單體CHAA的結構表征

疏水性單體CHAA 的1H NMR 譜圖見圖2。

圖2 N-環(huán)己基丙烯酰胺(CHAA) 的1H NMR 譜圖Fig.2 1H NMR Spectra of N-cyclohexylacrylamide

1H NMR (600 MHz，DMSO)δ7.93 (d，J=7.4 Hz，1H)，6.20 (dd，J=17.1，10.2 Hz，1H)，6.05 (dd，J=17.1，2.2 Hz，1H)，5.54 (dd，J=10.1，2.2 Hz，1H)，3.62～3.55 (m，1H)，1.78～1.52 (m，5H)，1.30～1.09 (m，5H)，證明單體成功合成。

2.2 PNCH納米凝膠的FTIR表征

利用傅里葉紅外光譜表征了PNCH納米凝膠的結構，見圖3。

圖3 單體NIPAM、CHAA和PNCH納米凝膠的 紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of monomer NIPAM，CHAA and PNCH nanogels

2.3 PNCH納米凝膠的微觀形貌表征

圖4顯示PNCH納米凝膠的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖像。

圖4 PNCH納米凝膠的SEM(a)和TEM(b)圖

由圖4可知，PNCH 納米凝膠的微觀內(nèi)部結構有相互連接的多孔結構存在，這些多孔結構具有藥物吸收/擴散和營養(yǎng)擴散輸送的能力，能應用于細胞培養(yǎng)或藥物輸送。TEM 圖像能看出PNCH納米凝膠均呈“軟球”狀，呈現(xiàn)良好的單分散性。

2.4 單體配比對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響

圖5為單體配比對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響。

圖5 不同單體配比的PNCH納米凝膠的 粒徑(a)及粒徑分布(b)圖

由圖5可知，隨著單體CHAA 比例(CHAA/NIPAM=3%～16%) 的增加，PNCH納米凝膠的粒徑從210.3 nm 減小到143.2 nm，這可能是由于隨著疏水性單體CHAA 含量的增加，納米凝膠的疏水性增強，凝膠體系中疏水部分之間相互吸引的分子間相互作用，削弱了聚合物內(nèi)部的相互作用[10]，因此粒徑減小。同時，PNCH納米凝膠均表現(xiàn)出良好的單分散性(PDI 均小于0.05)，不隨CHAA 的增加而分散性變差。

2.5 乳化劑SDS用量對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響

NIPAM與單體等比例，NIPAM∶CHAA∶BIS=95∶3∶2。添加不同用量的乳化劑SDS，分別溶于 100 mL 超純水中，乳化劑用量對PNCH納米凝膠粒徑及粒徑分布的影響見圖6。

圖6 不同SDS用量的PNCH納米凝膠的 粒徑(a)及粒徑分布(b)圖Fig.6 Particle size (a) and particle size distribution

由圖6可知，隨著乳化劑SDS 用量的增加，P(NIPAM-co-CHAA) 納米凝膠的粒徑從353.9 nm減小到152.8 nm。加入SDS前，凝膠體系的單分散指數(shù)較大(PDI=0.101)；加入后，單分散性明顯變好，降低為0.05 以下。這是由于乳化劑分子給出電荷形成帶電荷保護層[11]，阻止微滴彼此聚集，保持均勻的乳狀液，凝膠微球帶電荷保護層越多，粒徑越小[12-13]。

2.6 交聯(lián)劑BIS含量對PNCH納米凝膠粒徑及分散性的影響

實驗條件同2.5節(jié)，SDS用量0.05 g，交聯(lián)劑BIS用量對PNCH納米凝膠粒徑及粒徑分布的影響見圖7。

由圖7可知，隨著交聯(lián)劑BIS 含量的增加，P(NIPAM-co-CHAA)納米凝膠均表現(xiàn)出良好的單分散性(PDI 均小于0.05)，粒徑從210.3 nm減小到136.0 nm。交聯(lián)劑BIS 在線性的PNCH鏈段之間產(chǎn)生化學鍵，使線性鏈段相互交聯(lián)在一起，形成球狀結構。BIS 用量增多，納米凝膠交聯(lián)程度增加，鏈段糾纏越多，粒徑越小。

2.7 PNCH納米凝膠的溫度響應性

溫度變化范圍為20～40 ℃，增量為1 ℃。由 圖8 可知，不同單體配比的PNCH納米凝膠均表現(xiàn)出優(yōu)異的溫度響應性，隨著溫度的升高，納米凝膠的粒徑減小。PNCH納米凝膠在Tp以下，顯示親水性，凝膠膨脹呈藍色；而在高于Tp下，顯示疏水性，凝膠將收縮，分散性變差，凝膠發(fā)生相變變白。這是由于PNCH納米凝膠在較低溫度下，聚合物鏈上的親水基團與H2O 結合形成氫鍵，鏈段伸展，親水性明顯。隨著溫度的升高，氫鍵逐漸斷裂，與H2O 的相互作用力減弱。同時，聚合物鏈中疏水作用增強，鏈段開始收縮成疏水性明顯的球形結構，完成從無規(guī)鏈段向疏水小球的轉(zhuǎn)變。隨著疏水單體的增加，PNCH 納米凝膠的Tp 從28.1 ℃變?yōu)?5.8 ℃，這表明疏水性單體的引入增加了凝膠的疏水性，從而降低了體系的相變溫度。

圖8 不同單體配比的PNCH納米凝膠粒徑隨溫度 變化曲線；插圖顯示了納米凝膠的相變前后狀態(tài)

圖9 PNCH3 納米凝膠在D2O(10%) 中的變溫紅外光譜Fig.9 The temperature-dependent FTIR spectrum of PNCH3 nanogels in D2O (10%) variesa.3 020～2 800 cm-1(C—H)振動吸收峰區(qū)域；b.υas(CH3)頻率隨溫度的變化；c.υas(CH2)頻率隨溫度的變化；d.1 690～1 580 cm-1(CO)振動吸收峰區(qū)域；e.CO…D—N帶(1 690～1 653 cm-1)的積分面積變化；f.CO…D—O—D帶(1 624～1 580 cm-1)的積分面積變化

2.8 PNCH納米凝膠的體外細胞毒性

CCK-8測定中含有WST-8 染料：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，在電子耦合試劑1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(PMS) 存在的情況下，被細胞內(nèi)線粒體中的脫氫酶還原，形成水溶性較好的橙黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan)[19]。因此細胞增殖越多越快，活細胞數(shù)量越多，橙黃色甲瓚產(chǎn)物越多，顏色就越深；反之亦然。通過酶標儀測定 450 nm 處記錄Formazan的吸光度(OD 值)，就可以簡單地估計細胞活力。ANOVA 單因素檢驗，p<0.05。

小鼠上皮成纖維細胞(L-929)和PNCH納米凝膠培養(yǎng)24 h后的增殖分析圖和細胞活死染色圖見圖10。

由圖10b可知，培養(yǎng)24 h后活細胞占主導地位，24 h 內(nèi)僅觀察到微量死細胞，這表明納米凝膠具有良好的細胞相容性。CCK-8 測定增殖結果與上述結果一致，培養(yǎng)24 h 后，空白樣的OD 值為(0.25±0.01)，PNCH3、PNCH7和PNCH13納米凝膠的吸光度分別為(0.25±0.02)、(0.24±0.01)和(0.24±0.01)，三種納米凝膠同空白樣相比，增值速率沒有顯著性差異。這兩種實驗結果可以說明PNCH納米凝膠對小鼠上皮成纖維細胞(L-929) 沒有明顯的毒性，均能為其生長增殖提供一個良好的環(huán)境。這也表明PNCH納米凝膠能用于生物醫(yī)學領域，在組織工程、藥物負載等需要低毒性和良好生物相容性要求的領域具有廣闊的應用前景。

圖10 L-929 細胞與不同單體比例的PNCH 納米凝膠 培養(yǎng)24 h 后的增殖分析圖(a)和細胞活死染色圖(b)Fig.10 Proliferation analysis (a) and live-dead staining (b) of L-929 cells after 24 h incubation with different monomer ratios of PNCH nanogels

3 結論