外泌體在肺移植排斥反應中的作用研究進展

蔣冠宇 陳思遠 徐永瑞 鄭明峰 毛文君

肺移植是多種終末期肺病在替代手術和藥物治療失敗后的唯一治療方法[1]。自1963年第1例人類肺移植實施以來，全世界肺移植手術量已經超過65 000例[2]。盡管外科技術、供肺保存、免疫抑制管理以及對缺血-再灌注損傷和感染的處理都取得了進步，受者中位生存期在過去十年中從4.3年增加到6.5年[3]，但與其他實體器官移植相比，肺移植術后的存活率仍然較低。而急性排斥反應（acute rejection，AR）和以慢性移植肺功能障礙（chronic lung allograft dysfunction，CLAD）為主要表現的慢性排斥反應仍然是影響同種異體移植物長期存活的主要障礙[4]。

外泌體是真核生物細胞間通訊的一種胞外信號體，可以攜帶復雜生物信息，參與各種生理、病理過程，在靶細胞中引起多效性反應[5]。近年來外泌體在排斥反應和免疫耐受方面的研究逐漸增多，已經成為移植術后排斥反應中的重要免疫介質，在排斥反應的監(jiān)測和治療上也發(fā)揮著關鍵作用。目前國內關于外泌體在肺移植術后排斥反應中的研究較少，本文就肺移植術后排斥反應類型、外泌體調控排斥反應的機制、外泌體作為生物標志物及其在排斥反應治療中的應用等方面進行探討。

1 肺移植術后排斥反應

1.1 急性細胞介導排斥反應

急性細胞介導排斥反應（acute cellular rejection，ACR）是肺移植術后最常見的并發(fā)癥之一，被認為是導致CLAD的主要危險因素[6]。據國際心肺移植學會的注冊報告，28%的肺移植受者在術后第1年至少經歷一次AR。ACR是與主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）錯配和T細胞同種異體識別有關的適應性免疫的結果。細胞免疫在AR的發(fā)生發(fā)展過程中起主導作用[7]。ACR的診斷基于肺組織中血管周圍和間質出現單個核細胞浸潤。有ACR的肺移植受者可能沒有癥狀，也可能出現如低氧血癥，不同程度的呼吸困難、焦慮及乏力等相對典型的臨床表現。目前ACR的治療通常建議大劑量甲潑尼龍靜脈沖擊。

1.2 抗體介導的排斥反應

抗體介導的排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）是由受者體內抗供者人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和（或）非HLA抗體導致的排斥反應，是AR的另一種表現形式，可以單獨或與ACR同時發(fā)生，是導致慢性排斥反應和影響受者生存的主要因素之一[8]。在肺移植中，供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）與AMR密切相關[9]。AMR的組織病理學表現為中性粒細胞附壁、中性粒細胞性毛細血管炎、動脈炎和彌漫性肺泡損傷等。目前肺移植術后AMR沒有系統(tǒng)的治療方案，通常建議血漿置換及靜脈滴注免疫球蛋白和利妥昔單抗[10]。

1.3 慢性移植肺功能障礙

慢性排斥反應是肺移植術后受者長期存活的主要障礙。CLAD是慢性排斥反應最主要的形式，主要包括以限制性通氣障礙、周邊肺纖維化改變?yōu)樘卣鞯南拗菩砸浦参锞C合征（restrictive allograft syndrome，RAS）和以慢性小氣道阻塞性改變?yōu)樘卣鞯拈]塞性細支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrome，BOS）[11]。CLAD的形成和發(fā)展涉及多種因素的相互作用，包括移植后誘導的炎癥、移植后感染以及針對供者抗原的同種異體免疫和自身免疫之間的相互作用等[12]。目前慢性排斥反應的治療效果不佳，通常采用個體化治療方案。若病情持續(xù)進展，則需再次進行肺移植[13]。

2 外泌體在肺移植中的作用研究現狀

外泌體在細胞間相互通訊中起著重要作用，是目前人們廣泛關注的一類細胞外納米囊泡。外泌體于分泌細胞的多囊體內形成，組成取決于細胞的起源、疾病狀態(tài)和病理生理條件，主要由脂質雙層、跨膜蛋白和核心內容[包括特定和非特定蛋白、信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）、微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）和長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）]構成，存在于多種生物體液中[14]，主要參與膜融合和轉運等。外泌體具有組織特異性的表面受體特征，可以通過轉移蛋白質、轉錄因子、脂質、mRNA和miRNA介導細胞間的通訊[15]。外泌體與靶細胞融合后將功能性受體傳遞到靶細胞，在某些情況下甚至可以激活受體和效應器，并改變靶細胞的功能[16]。此外，外泌體已被證明可以改變變態(tài)反應中的細胞學行為，還能夠通過MHC抗原以及巨噬細胞激活T細胞[17]。

在肺移植中，供者來源的外泌體主要表達自身抗原和供者HLA。據Ravichandran等[18]報道，在肺移植術后，當移植器官不處于應激狀態(tài)時，含有供者HLA和自身抗原的外泌體不會釋放入循環(huán)。當發(fā)生排斥反應時，可以在循環(huán)和支氣管肺泡灌洗液中檢測到組織特異性外泌體。據Sharma等[19]研究發(fā)現，診斷為AR和CLAD的肺移植受者的血清和支氣管肺泡灌洗液中，存在具有不同抗原特性的外泌體，這些外泌體包含的mRNA和免疫調節(jié)miRNA也不相同。從診斷為排斥反應的肺移植受者中分離到的外泌體不僅含有供者來源的HLA，而且還含有肺相關自身抗原，如Ⅴ型膠原和K-α1微管蛋白等[19]。外泌體在正常和免疫損傷狀態(tài)下具有不同的RNA譜。據Gregson等[17]研究發(fā)現，正常和發(fā)生AR的患者之間的外泌體穿梭RNA（exosomal shuttle RNA，esRNA）群體特征明顯不同。esRNA譜介導對于基本肺功能至關重要的代謝途徑，如膠原生物合成、血小板衍生生長因子信號傳導、細胞表面相互作用、補體級聯和煙堿型乙酰膽堿受體信息傳遞等。在肺移植術后靜止狀態(tài)下的基礎肺代謝途徑被過度表達，而在AR人群中則顯示出抗原處理以及先天免疫和獲得性免疫激活的esRNA歪曲表達譜。目前已經發(fā)現某些具有獨特特征的供者來源外泌體在肺移植術后被釋放，然而，其在肺移植中的作用相關研究仍處于初級階段。

3 外泌體在肺移植術后排斥反應中的作用

3.1 外泌體調控肺移植術后排斥反應的機制

細胞免疫和體液免疫過程在排斥反應的發(fā)病機制中起重要作用。同種異體識別是肺移植術后排斥反應的重要過程，受者的免疫系統(tǒng)識別來自供者器官的錯配MHC抗原，并激活T細胞，啟動同種異體移植排斥反應[20]。在同種異體免疫領域，有幾條途徑描述了以上過程，包括直接同種異體識別、間接同種異體識別、半直接同種異體識別和固有同種異體識別（圖1）。與之相反，調節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）在排斥反應中主要發(fā)揮免疫耐受的功能。而外泌體的參與是其中不可缺少的一環(huán)。

圖1 外泌體介導的同種異體識別途徑Figure 1 Exosome-mediated allogeneic recognition pathway

3.1.1 直接同種異體識別 直接同種異體識別途徑解釋了淋巴器官中的受者T細胞如何識別供者抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC）表面的 MHC-抗原肽復合物（peptide-MHC，p-MHC）。在肺移植術后早期，供者APC來源外泌體遷移到受者次級淋巴器官，激活直接途徑中的幼稚T細胞，產生同種異體反應性T細胞。T細胞直接識別同種異體抗原后引發(fā)大規(guī)模的多克隆性炎癥反應，從而導致同種異體移植AR[21]。最近有證據表明，外泌體在直接途徑中可以提高T細胞對供者MHC抗原的同種異體致敏效率。外泌體維持起始APC的拓撲結構，暴露囊泡表面MHC抗原的胞外區(qū)。APC釋放的外泌體攜帶親代細胞表面的MHC抗原，具有直接刺激CD8+T細胞和CD4+T細胞的能力[22]。

3.1.2 間接同種異體識別 隨著供者APC減少，間接同種異體識別途徑在慢性排斥反應中起主要作用。慢性排斥反應主要由CD4+T細胞和同種異體反應性抗體的產生所主導。通過間接同種異體識別途徑，供者APC來源的外泌體被受者APC內化，由自身MHCⅡ類抗原處理后呈多肽形式遞送給CD4+T細胞，這種機制在同種異體移植的整個過程中都是持續(xù)的[23]。研究表明，外泌體攜帶的供體p-MHC可以作為肽的來源，當被APC通過吞噬或微胞吞噬作用內化時，可以間接激活T細胞。

3.1.3 半直接同種異體識別 當供者來源外泌體表面的完整MHC抗原從供者APC轉移到受者APC，然后由受者APC提呈給T細胞時，半直接同種異體識別途徑就會發(fā)生，這是外泌體介導排斥反應的主要方式。通過半直接同種異體識別，受者APC不僅能夠提呈供者來源的完整MHC抗原以激活直接同種異體反應中的幼稚CD8+T細胞，還能提呈受者MHC抗原中供者衍生肽以刺激間接同種異體反應中的CD4+T細胞[24]。這一機制使得直接和間接激活的T細胞能夠通過同一APC進行交叉調節(jié)。受者APC與供者APC來源的外泌體融合并發(fā)生交叉修飾，顯示完整的p-MHC。APC在體內能夠將獲得的同種異體抗原作為完整的p-MHC在細胞表面長時間保留和濃縮。而外泌體以小簇的形式黏附在受者APC表面，保留完整且功能正常的供者MHC抗原和APC激活信號。如果捕獲的外泌體表達同種異體MHC Ⅱ類抗原，還有可能發(fā)生多肽特異的同種異體反應，即以同種異體限制性的方式將新的多肽提呈給受者CD4+T細胞。外泌體不僅可以將抗原靶標傳播到全身，而且還可以產生導致細胞產物上調或下調的指令[25]。有研究表明，樹突狀細胞（dendritic cell，DC）可以誘導排斥反應或免疫耐受，這取決于它們的表型和（或）成熟階段[26]。成熟的DC可以刺激免疫反應，分泌的外泌體能夠激活T細胞；未成熟DC來源的外泌體（immature DC-derived exosome，imDEC），其MHC抗原表達水平較低，具有調節(jié)功能和抑制免疫應答的作用。此外，imDEC表達FasL，引起T細胞凋亡[14]。因此，根據釋放外泌體的DC狀態(tài)，可以產生刺激或抑制免疫反應的雙重作用。

3.1.4 固有同種異體識別 固有免疫通過受者體內的成熟DC激活效應T細胞并誘導巨噬細胞產生同種異體毒性來觸發(fā)或增強同種異體移植物排斥反應，包括巨噬細胞吞噬和抗原提呈、移植物內DC成熟以及同種異體反應性與供者特異性外泌體的分泌，這些外泌體遷移到受者淋巴組織后進行進一步的抗原處理。有研究指出，供者單個核細胞和分泌的外泌體上存在一種信號調節(jié)蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα），易引發(fā)同種異體排斥反應。由于供者特異性外泌體在移植術后持續(xù)存在于淋巴組織中，基于外泌體的固有同種異體識別可能是慢性排斥反應發(fā)生過程的重要一環(huán)[22]。

3.1.5 調節(jié)性T細胞 此外，據Pang等[27]報道，外泌體是Treg用來維持免疫耐受的重要工具。Treg可通過多種機制抑制排斥反應，包括抑制CD4+T細胞、CD8+T細胞的增殖和激活，抑制B細胞反應，調節(jié)巨噬細胞和自然殺傷細胞功能。而通過外泌體轉運miRNA是Treg的核心功能。Treg介導的免疫耐受需要通過外泌體將miR-let-7d從Treg轉移到CD4+T細胞。除了T細胞，Treg來源外泌體還可以調控APC，使它們偏向耐受表型。Treg來源外泌體修飾的DC改變了它們的細胞因子分泌譜及表面表達的免疫抑制分子，而在其中發(fā)揮關鍵作用的miRNA是miR-142-3p。據報道，miR-142-3p轉染可干擾髓系細胞的每一步抗原提呈過程，包括降低吞噬功能、抑制抗原消化和表位加工以及增加程序性細胞死亡蛋白配體1的表達，最終導致APC無法激活T細胞[28]。

3.2 外泌體作為檢測肺移植術后排斥反應的指標

早期、可靠地診斷肺移植術后排斥反應是肺移植受者良好預后的關鍵。體液中外泌體的存在反映了器官和組織的組織學和生理學特征，外泌體的含量和表面標志物在發(fā)生排斥反應和未發(fā)生排斥反應受者中存在很大的差異，可以作為一種非侵入性的可靠方法來檢測同種異體移植排斥反應[21]。據Gunasekaran等[20]報道，在臨床診斷前，伴有AR和BOS的肺移植受者血清中可檢測到含有自身抗原的外泌體。BOS受者的外泌體內肺相關自身抗原含量（包括K-α1微管蛋白和Ⅴ型膠原）較未發(fā)生排斥反應受者顯著升高[20]。研究發(fā)現，移植前或移植后存在的抗自身抗原抗體會導致同種異體移植物存活率降低，提示外泌體表達自身抗原會誘導體液免疫反應，導致同種異體移植物功能障礙。Gunasekaran等[29]研究發(fā)現，MHCⅡ類反式激活因子（MHC classⅡtransactivator，CⅡTA）、核因子（nuclear factor，NF）-κB、低氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α、Toll樣 受 體（Toll-like receptor，TLR）4途徑相關分子白細胞介素1受體相關激酶1（interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）和髓 樣分化因 子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）存在于發(fā)生排斥反應的肺移植受者的外泌體中，而在穩(wěn)定的肺移植受者的外泌體中不存在。同時，未發(fā)生排斥反應受者的外泌體不表達MHCⅡ類抗原和共刺激分子（CD80、CD86、CD40），但發(fā)生排斥反應和未發(fā)生排斥反應的受者均表達黏附分子[14]。外泌體還含有能夠誘導炎癥、內皮激活、AMR和輔助性T細胞（helper T cell，Th）17分化的miRNA，這些miRNA參與B細胞、T細胞免疫反應和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β信號通路，調節(jié)重要的細胞過程，可能引發(fā)AR和BOS進展，如miR-144是BOS的一個主要生物標志物[30]。此外，肺移植術后外泌體的不同變化可能與不同類型的排斥反應有關[31]。Bansal等[32]研究發(fā)現，伴有RAS的肺移植受者體內外泌體中含有DSA。RAS來源的外泌體中參與MHCⅡ類抗原激活的轉錄因子CⅡTA、多聚體免疫球蛋白受體（polymeric immunoglobulin receptor，PIGR）、促炎轉錄因子NF-κB、20S蛋白酶體、HLA-DQ和HLADR均顯著高于BOS來源的外泌體。在出現移植肺損傷的組織學表現之前，循環(huán)中的供者特異性外泌體譜可以早期檢測排斥反應[33]，用于評估同種異體移植物的狀態(tài)以及排斥反應的性質和嚴重程度，有助于預測排斥反應的發(fā)生并及時調整治療方案。各類外泌體標志物在肺移植術后不同狀態(tài)下的表達情況見表1。

表1 外泌體標志物在肺移植術后不同狀態(tài)下的表達情況Table 1 Expression of exosome markers in different conditions after lung transplantation

3.3 外泌體在肺移植術后排斥反應中的治療應用

肺移植受者術后需要應用免疫抑制劑來抑制排斥反應，雖然AR能得到較好的控制，但長期使用免疫抑制劑會產生許多不良反應，而且并不能預防CLAD。針對同種異體移植排斥反應，人們提出了不同的替代療法，主要基于預先輸注不同類型的調節(jié)性細胞，包括DC、間充質干細胞和T細胞等。然而，這些方法缺乏效率，并且在適用性方面存在許多問題[34]。而外泌體在免疫調節(jié)中的作用已引起人們的廣泛興趣，可能成為誘導移植后免疫耐受和存活的一種無細胞替代方法。根據Lee 等[35]的報道，骨髓間充質干細胞來源的外泌體在調節(jié)各種免疫細胞亞群，促進免疫動態(tài)平衡方面發(fā)揮作用，其通過T細胞凋亡、增加Treg數量和釋放白細胞介素（interleukin，IL）-10表現出很強的免疫抑制活性。外泌體還可以通過抑制單個核細胞向DC的分化、改善Treg的功能、抑制自然殺傷細胞和CD8+T細胞的活性來減弱免疫反應[36]。Yu等[37]研究發(fā)現，外泌體是Treg在同種異體移植免疫耐受中的遠端調控機制之一，其釋放的外泌體可以作為一種新型的免疫抑制劑以減輕同種異體移植排斥反應。imDEC可以抑制炎癥和自身免疫反應，在Treg分化和誘導免疫耐受中發(fā)揮重要作用[27]。雖然單用外泌體治療在延長同種異體移植物的存活時間上是有益的，但并不能誘導免疫耐受。而使用imDEC并聯合短期免疫抑制劑或供者抗原特異性Treg，同種異體移植物存活時間會更長。外泌體誘導移植免疫耐受是一個研究要點，并可能在移植術后免疫抑制療法上開辟新的道路，結合它們作為藥物載體的能力，將會成為生物醫(yī)學和生物技術未來著重發(fā)展的方向之一。

4 小結與展望

外泌體是促進細胞間相互交流的一種重要囊泡，具有調節(jié)免疫的作用。通過直接、間接或半直接等同種異體識別途徑，外泌體在肺移植術后排斥反應中發(fā)揮調控作用。而具有某些特征的外泌體可以作為潛在的生物標志物來識別有排斥反應風險的受者。此外，外泌體作為新興治療方式可以延長同種異體移植物的存活時間。因此，外泌體介導的同種異體識別途徑可能為解決肺移植領域的新問題方面提供新思路。但要想探明從移植器官中誘導外泌體的過程，并闡明這種誘導如何在排斥反應的免疫病理機制中起作用，尚需進一步研究。