肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者淋巴細(xì)胞亞群的變化及意義

王若麟 李瀚 賈亞男 許文犁 李先亮 賀強(qiáng) 朱繼巧

急性排斥反應(yīng)是肝移植術(shù)后早期的主要并發(fā)癥，可影響肝移植受者的生存質(zhì)量和生存時間[1-2]。早期預(yù)測和發(fā)現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，才能將其對移植肝的損害降到最低程度。肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)的常見危險(xiǎn)因素包括嚴(yán)重的缺血-再灌注損傷、受者免疫反應(yīng)較強(qiáng)、ABO血型不相容等[3]，其中外周血中淋巴細(xì)胞亞群在同種異體移植物的免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。但目前的研究主要集中在特定的淋巴細(xì)胞亞群上[4-10]，而外周血淋巴細(xì)胞亞群整體對移植物反應(yīng)的變化規(guī)律仍缺乏了解。為此，本項(xiàng)研究回顧性分析首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者外周血淋巴細(xì)胞亞群的變化，旨在為肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2021年8月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院肝膽胰脾外科接受肝移植且發(fā)生急性排斥反應(yīng)的17例受者納入排斥組，其中男15例，女2例，年齡49（42，55）歲，原發(fā)病包括肝惡性腫瘤6例，良性疾病11例（肝炎后肝硬化7例、酒精性肝硬化3例、急性肝衰竭1例） ；按性別、年齡（±3歲）、原發(fā)?。◥盒曰蛄夹裕┖碗S訪期（±5 d）匹配的術(shù)后肝功能穩(wěn)定受者17例納入對照組，其中男15例，女2例，年齡46（43，57）歲，肝惡性腫瘤6例，良性疾病11例（肝炎后肝硬化9例、酒精性肝硬化1例、急性肝衰竭1例）。

排斥組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、煩躁，移植肝腫大和肝區(qū)局部壓痛，出現(xiàn)黃疸或進(jìn)行性加重，留置T管的受者膽汁分泌量突然減少、膽汁稀薄且顏色變淡等；（2）實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)血清膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)升高、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶升高以及凝血酶原時間延長；（3）移植物活組織檢查符合Banff標(biāo)準(zhǔn)中的急性排斥反應(yīng)。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）利用傾向評分匹配方法，與排斥組按1∶1比例選取同期行肝移植手術(shù)且無急性排斥反應(yīng)的患者；（2）無急性排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查陽性指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）行肝臟及其他器官聯(lián)合移植；（2）合并其他疾病導(dǎo)致免疫功能下降者，如合并獲得性免疫缺陷綜合征、血液腫瘤、先天性免疫功能低下等；（3）病歷資料不全或失訪。

1.2 治療方案

受者均為ABO血型相容肝移植，供者來源均為尸體器官捐獻(xiàn)。手術(shù)方式均采用改良背馱式原位肝移植術(shù)，術(shù)中開放門靜脈前常規(guī)使用甲潑尼龍（靜脈滴注500 mg）和乙型肝炎免疫球蛋白（靜脈滴注5 000～10 000 U）。采用靜脈滴注巴利昔單抗或豬抗人T細(xì)胞免疫球蛋白進(jìn)行免疫誘導(dǎo)治療。術(shù)中酌情使用新鮮冰凍血漿、纖維蛋白原、凝血酶原復(fù)合物及血小板等。術(shù)后常規(guī)應(yīng)用頭孢哌酮鈉-舒巴坦鈉預(yù)防細(xì)菌感染。術(shù)后早期采用他克莫司+霉酚酸酯類藥物+糖皮質(zhì)激素（激素）的三聯(lián)免疫抑制方案。白細(xì)胞明顯降低者停用霉酚酸酯類藥物，除自身免疫性肝病的肝移植受者或發(fā)生排斥反應(yīng)較重受者維持低劑量激素治療，多數(shù)受者術(shù)后常規(guī)1～2個月內(nèi)停止使用激素。對于惡性腫瘤、腎功能不全受者，根據(jù)傷口愈合情況，術(shù)后1個月加用西羅莫司，并酌情降低他克莫司劑量。移植前乙型肝炎表面抗原陽性的受者，術(shù)后使用恩替卡韋及乙型肝炎人免疫球蛋白預(yù)防復(fù)發(fā)?？古懦夥磻?yīng)治療首選增加他克莫司劑量，效果不佳者接受激素沖擊治療。

1.3 主要試劑

淋巴細(xì)胞分離液購自美國GE公司。流式細(xì)胞術(shù)的抗體均購自美國BD公司，包括異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）-抗CD3、CY5.5-抗 CD4、CY5.5-抗 CD8、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-抗 CD19、別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）-抗 CD16、PE-抗 CD56、PE-抗CD4、FITC-抗Lin1、多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物（peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP）/CY5.5-抗CD123和APC-抗CD11C。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

排斥組在受者出現(xiàn)符合急性排斥反應(yīng)的臨床表現(xiàn)且尚未進(jìn)行抗排斥反應(yīng)治療前采外周靜脈血5 mL，對照組在相近的時間采外周靜脈血5 mL，置于乙二胺四乙酸鹽抗凝管中即刻送至實(shí)驗(yàn)室。將靜脈血加入15 mL離心管中，離心后移除上層血 漿。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋血細(xì)胞懸液，緩慢加至淋巴細(xì)胞分離液上方，離心后用移液管緩慢吸取外周單個核細(xì)胞層。加入PBS后洗滌、300×g離心5 min。進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。分別加入100 μL細(xì)胞液和相應(yīng)抗體混勻，避光孵育20 min。加入2 mL PBS重懸，離心棄上清，再加入400 μL PBS混勻后進(jìn)行流式檢測。檢測對照組及排斥組受者T細(xì)胞（CD3+）、CD4+T細(xì)胞（CD3+CD4+）、CD8+T細(xì)胞（CD3+CD8+）、B細(xì)胞（CD19+）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞（CD56+CD16+）、NKT細(xì)胞（CD3+CD56+CD16+）和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）（Lin1-CD11c+、Lin1-CD123+）絕對值和比例。在排斥組抗排斥反應(yīng)治療后對受者進(jìn)行第2次采樣，采樣時間為治療后8～26 d。

1.5 研究內(nèi)容

總結(jié)肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生情況及排斥組、對照組他克莫司濃度，比較肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者淋巴細(xì)胞亞群的變化；分析淋巴細(xì)胞亞群對肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的診斷價值；比較抗排斥反應(yīng)治療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，比較采用秩和檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析進(jìn)行多因素分析，對淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)受者淋巴細(xì)胞亞群的變化

排斥組17例受者中，4例在術(shù)后28 d內(nèi)發(fā)生急性排斥反應(yīng)，13例在術(shù)后29～180 d發(fā)生急性排斥反應(yīng)。排斥組與對照組他克莫司谷濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [（6.0±4.2）ng/mL比（7.1±2.8）ng/mL，P=0.295]。

與對照組比較，排斥組受者外周血T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NKT細(xì)胞的比例均上升（均為P＜0.05），其余淋巴細(xì)胞亞群的絕對值和比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05，圖1）。

圖1 對照組和排斥組肝移植受者淋巴細(xì)胞絕對值和比例的比較Figure 1 Comparison of absolute value and proportion of lymphocytes in liver transplant recipients between control group and rejection group

2.2 淋巴細(xì)胞亞群對肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的診斷價值

logistic回歸分析結(jié)果提示，肝移植術(shù)后早期（6個月內(nèi)），NKT細(xì)胞比例升高是肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[比值比（odds ratio，OR）1.774，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）1.059～2.971，P=0.029，表1]。

表1 淋巴細(xì)胞亞群對肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的診斷價值的logistic回歸分析Table 1 Logistic regression analysis of the diagnostic value of lymphocyte subsets for acute rejection after liver transplantation

ROC曲線分析結(jié)果提示，CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例的曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.76、0.73和0.77。聯(lián)用CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例的二分類變量邏輯回歸計(jì)算診斷價值時，AUC為0.89，當(dāng)臨界值為0.69時，靈敏度為0.706，特異度為0.941（圖2）。

圖2 淋巴細(xì)胞亞群診斷急性排斥反應(yīng)的ROC曲線Figure 2 ROC curves of lymphocyte subsets for the diagnosis of acute rejection

2.3 排斥組治療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化

排斥組9例受者因他克莫司效果不佳而接受激素沖擊治療，所有受者均逐漸恢復(fù)，最終肝功能正常。排斥組受者治療后T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例均降低（均為P＜0.05），而淋巴細(xì)胞亞群絕對值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05，圖3）。

圖3 抗排斥反應(yīng)治療前后淋巴細(xì)胞亞群絕對值和比例的比較Figure 3 Comparison of absolute value and proportion of lymphocyte subsets before and after anti-rejection treatment

3 討 論

肝移植術(shù)后早期受者常受到急性排斥反應(yīng)的困擾，嚴(yán)重影響受者的生存，其中外周血不同淋巴細(xì)胞亞群在急性排斥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。Louis等[8]發(fā)現(xiàn)在發(fā)生抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)的受者血液中存在輔助性T細(xì)胞增殖；Lemerle等[9]研究表明較高的CD8+T細(xì)胞水平可能增加急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；Schl??er等[10]揭示急性排斥反應(yīng)與活化B細(xì)胞與漿母細(xì)胞的增殖有關(guān)；Koenig等[11]報(bào)道缺少自我誘導(dǎo)的NK細(xì)胞活化會造成內(nèi)皮損傷，引起慢性血管排斥反應(yīng)，從而導(dǎo)致移植失敗。但目前所報(bào)道的相關(guān)研究主要集中在某一特定的細(xì)胞亞群上，外周血淋巴細(xì)胞亞群整體的變化規(guī)律仍不明確。急性排斥反應(yīng)是細(xì)胞免疫和體液免疫與先天性免疫系統(tǒng)共同作用的聯(lián)合反應(yīng)[12-14]。外周血淋巴細(xì)胞作為一個整體，每個細(xì)胞亞群都相互關(guān)聯(lián)，有必要探究其變化規(guī)律[14-18]。

本研究中肝移植術(shù)后淋巴細(xì)胞亞群變化的分析結(jié)果顯示，排斥組與對照組受者在接受相似的免疫抑制治療（他克莫司濃度相當(dāng)）情況下，T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NKT細(xì)胞的比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余淋巴細(xì)胞亞群的絕對值和比例均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NKT細(xì)胞參與急性排斥反應(yīng)。在心臟移植中，急性排斥反應(yīng)受者循環(huán)CD4+T細(xì)胞比例較高[19]。van Besouw等[20]報(bào)道CD4+T細(xì)胞可通過分泌細(xì)胞因子途徑增加排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。目前普遍認(rèn)為B細(xì)胞既可以通過提呈細(xì)胞分泌抗體、激活補(bǔ)體等方式發(fā)揮免疫激活作用，參與抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，同時也可通過分泌細(xì)胞因子抑制免疫反應(yīng)[21-23]。San Segundo等[23]發(fā)現(xiàn)，外周血中B細(xì)胞在無排斥反應(yīng)征象的受者中減少，在有移植腎排斥反應(yīng)的受者中顯著升高，提示移植前外周血B細(xì)胞比例增加可以識別有急性排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的受者。本研究發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞比例是肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。NKT細(xì)胞是一種先天性免疫細(xì)胞，在T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）參與時可釋放促炎和抗炎細(xì)胞因子，并表現(xiàn)出強(qiáng)大的調(diào)節(jié)特性[24]。NKT細(xì)胞被認(rèn)為可誘導(dǎo)耐受性[25-26]，NKT細(xì)胞比例的增加表明其可能參與急性排斥反應(yīng)的局部控制[27-28]。ROC曲線分析結(jié)果提示，聯(lián)用CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例可早期發(fā)現(xiàn)和診斷急性排斥反應(yīng)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證外周血淋巴細(xì)胞亞群比例在排斥反應(yīng)中的作用，我們對排斥組受者行抗排斥反應(yīng)治療后再次進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)治療后T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例均降低，而絕對值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NKT細(xì)胞比例也出現(xiàn)了下降趨勢，但可能由于外周血NKT細(xì)胞計(jì)數(shù)較少、占比較低，且本研究僅納入了17例受者，檢測結(jié)果存在較大的個體差異性，導(dǎo)致與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究報(bào)道，在使用潑尼松或他克莫司后，受者會出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞減少，其中以T細(xì)胞和NK細(xì)胞更為顯著[29-30]，而這些淋巴細(xì)胞減少的排斥組受者在抗排斥干預(yù)后肝功能均逐步恢復(fù)正常，進(jìn)一步證明淋巴細(xì)胞亞群比例改變與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，外周血淋巴細(xì)胞亞群比例改變是急性排斥反應(yīng)的重要表現(xiàn)，NKT細(xì)胞比例升高是發(fā)生急性排斥反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，在肝移植術(shù)后監(jiān)測淋巴細(xì)胞亞群比例變化，對早期防治急性排斥反應(yīng)具有重要作用。