表達人源補體調(diào)節(jié)蛋白hCD55對異種胰島移植的保護作用

李欣 潘登科 周佳 閆杰 陳軍 杜嘉祥 龔曼琳

1型糖尿病是胰島β細胞被破壞而導(dǎo)致胰島素絕對缺乏的一種慢性自身免疫性疾病，是遺傳因素、環(huán)境因素、微生物、代謝和免疫系統(tǒng)之間相互作用的結(jié)果[1-4]。糖尿病發(fā)展到后期會產(chǎn)生許多并發(fā)癥，將嚴重影響患者的生活質(zhì)量[5-9]。

胰腺移植和胰島移植是治療嚴重糖尿病患者的有效途徑，胰島移植相比于胰腺移植，具有創(chuàng)傷小、風(fēng)險小等優(yōu)勢[10-13]。同種胰島移植存在供者來源短缺的問題，異種胰島移植是解決這一問題的有效途徑[14-17]。豬被認為是最佳的異種胰島供體，但當(dāng)豬胰島細胞暴露于受體的血液中會產(chǎn)生立即經(jīng)血液介導(dǎo)的炎癥反 應(yīng)（instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR），其中抗原抗體結(jié)合從而激活補體系統(tǒng)是觸發(fā)IBMIR的一個關(guān)鍵因素[14,18-20]。α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，αGal）是豬到人重要的異種抗原，由α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）催化合成，用敲除該抗原的豬胰島細胞進行異種移植能減少免疫排斥反應(yīng)[21-22]。

補體是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一，已發(fā)現(xiàn)經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑3種激活方式，它們有共同的終末反應(yīng)，最終形成攻膜復(fù)合物[23-27]。CD55通過抑制補體級聯(lián)激活經(jīng)典途徑和替代途徑中C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性，從而減少攻膜復(fù)合物的形成[28-29]。成都中科奧格生物科技有限公司自主制備了人類簇分化抗原55（human cluster of differentiation 55，hCD55）蛋白高表達小型豬，且已在外周血單核細胞上完成驗證[30]。hCD55蛋白在豬胰島細胞的表達情況及發(fā)揮抑制補體激活的作用效果尚未進行研究，由此本文設(shè)計相關(guān)實驗，驗證hCD55在豬胰島細胞上的表達及其保護作用，為hCD55在異種胰島移植中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

所用4只小型豬（18月齡及以上）均來自于成都中科奧格生物科技有限公司，飼養(yǎng)于普通級豬舍，自由進食與飲水。用于分離胰島細胞的3只豬基因型分別為WT（野生型）、GTKO（GGTA1基因敲除）、GTKO/hCD55；用于采集豬耳組織樣品的1只豬基因型為hCD55。本研究經(jīng)成都中科奧格生物科技有限公司倫理委員會批準(zhǔn)。

健康人混合新鮮血清的收集均在征求當(dāng)事人同意的情況下采集，來源為A、B、O型血志愿者各3名，將3種血型血清等比混合。

主要試劑包括：Hank’s平衡鹽溶液、RPMI 1640培養(yǎng)基（溫州怡康公司），無糖DMEM培養(yǎng)基、Ham’s F10培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司），雙硫棕（dithizone，DTZ）、豬胰島素檢測試劑盒（北京索萊寶公司），通用基因組DNA小量提取試劑盒、微量總RNA提取試劑盒（北京天漠公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金公司），小鼠抗人CD55-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標(biāo)記單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人C3c-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記抗體、兔抗人C4c-FITC標(biāo)記抗體（北京中杉金橋公司），小鼠抗人C5b-9單克隆抗體（丹麥DAKO公司），山羊抗鼠IgG-Dylight 488標(biāo)記二抗（美國Abbkine公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 成年豬胰島細胞分離及純度檢測 成年豬麻醉后開腹，從豬左腎部位邊的主動脈插入10 mL移液管放血，待放血接近完全時，找到胰腺組織，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖淋胰腺使其降溫，用無菌鈍彎剪小心剝離胰腺旁組織取出完整豬胰腺，置于預(yù)冷的Hank’s平衡鹽溶液中。用無菌彎鈍剪將胰腺上的脂肪、結(jié)締組織等修剪干凈后稱重。將膠原酶灌注進豬胰腺直至充盈，灌注后的豬胰腺剪成大小均一的組織塊進行消化，期間取樣進行DTZ染色（DTZ可與胰島β細胞中的鋅離子螯合而使細胞顯猩紅色），顯微鏡下觀察細胞染色，出現(xiàn)猩紅色時終止消化。收集消化后的組織并用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基洗滌，通過不連續(xù)密度梯度法對收集的組織進行純化，最終離心管底部沉淀即為胰島細胞。將胰島細胞按照接種密度為1×104胰島當(dāng)量（islet equivalent，IEQ）/30 mL Ham’s F10培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.2.2 葡萄糖刺激的胰島素分泌及其檢測 分別取100 IEQ WT、GTKO、GTKO/hCD55 豬胰島細胞，用無糖DMEM培養(yǎng)基重懸胰島細胞，放入直徑12 mm，孔徑12 μm篩網(wǎng)中，將篩網(wǎng)置于無菌紗布上將無糖DMEM培養(yǎng)基吸干，隨后放入2.6 mmol/L的低糖溶液中，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。低糖溶液孵育后，吸取低糖溶液于1.5 mL離心管中暫時保存于4 ℃冰箱，再用鑷子將裝有胰島細胞的篩網(wǎng)放置于26 mmol/L的高糖溶液，37 ℃孵育1 h，高糖溶液刺激完以后同樣操作將高糖溶液儲存于4 ℃冰箱。采用豬胰島素檢測試劑盒測定高、低糖溶液中的豬胰島素含量，糖刺激指數(shù)=A1/A2×100，其中A1為26 mmol/L高糖溶液刺激后的豬胰島素含量，A2為2.6 mmol/L低糖溶液刺激后的豬胰島素含量。

1.2.3 引物設(shè)計 在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）中查找已有豬β-actin基因（Gene ID：414396）序列、hCD55基因編碼序列（coding sequence，CDS）（Gene ID：NM_000574）和豬β-actin基因CDS（Gene ID：XM_003124280），使用NCBI Primer-Blast在線軟件設(shè)計特異性引物（表1），由北京擎科生物公司合成。

表1 引物序列信息Table1 Information of primer sequences

1.2.4 DNA水平鑒定 取分離培養(yǎng)GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞團和hCD55豬耳組織樣品（耳部采用75%乙醇反復(fù)消毒后，剪取耳廓組織，大小約為1.0 cm×0.2 cm），按基因組DNA提取試劑盒操作說明書分別提取DNA，使用微量核酸測定儀測定DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。取hCD55豬耳樣DNA、WT豬胰島DNA、GTKO/CD55豬胰島DNA為模板，分別添加引物進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、拍照。

1.2.5 RNA水平鑒定 取分離培養(yǎng)的GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞團，按總RNA提取試劑盒操作說明書分別提取總RNA，檢測RNA的完整性，微量核酸測定儀測定，定量后分別取500 ng 總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。分別添加引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳、拍照。

1.2.6 蛋白水平鑒定 取分離培養(yǎng)的WT、GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞團，過70 μm細胞篩，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗收集篩網(wǎng)上大于70 μm的細胞團，離心棄上清后加入0.05%的胰酶（不含乙二胺四乙酸），37 ℃消化5～8 min，期間用移液器輕柔吹打分散至單個細胞，加入含10%胎牛血清的PBS終止消化，離心棄上清，PBS重懸細胞，過40 μm細胞篩去除未消化的細胞團。將收集的胰島單細胞離心棄上清，重懸，加入5 μL小鼠抗人CD55- PE標(biāo)記單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，重懸細胞后采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.7 補體依賴的細胞毒性實驗 取分離培養(yǎng)的WT、GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞團，按1.2.6中所述分離單個胰島細胞，分別加入各比例稀釋的混合新鮮人血清（血清終濃度依次為1∶2、1∶4、1∶8）及空白對照組（加入PBS），37 ℃孵育30 min，PBS洗2次，重懸加入碘化丙啶溶液，4 ℃避光孵育8 min，采用流式細胞儀檢測細胞死亡比例。獨立實驗重復(fù)6次。細胞毒性（%）=[（A-C）/（B-C）]×100%，其中A為細胞死亡比例，B為細胞最大死亡比例，一般為98%～100%，C為細胞最小死亡比例。

1.2.8 人補體沉積檢測 取分離培養(yǎng)的WT、GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞團，按1.2.6中所述分離單個胰島細胞，分別加入稀釋后的混合新鮮人血清（血清終濃度為1∶6），37 ℃孵育30 min，PBS洗2次，分別加入兔抗人C3c-FITC標(biāo)記抗體、兔抗人C4c-FITC標(biāo)記抗體、小鼠抗人C5b-9單克隆抗體，4 ℃避光孵育30 min，C5b-9組再加入山羊抗鼠IgGDylight 488標(biāo)記二抗，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌細胞并重懸后，采用流式細胞儀進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey多重比較檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 豬胰島細胞團純度和胰島素分泌功能檢測

分離WT、GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞團，DTZ染色結(jié)果顯示豬胰島細胞團純度＞75%（圖1）。

圖1 3種豬胰島細胞團的純度檢測Figure 1 Purity detection of three porcine islet cell mass

特異性豬胰島素試劑盒計算得到WT、GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞的糖刺激指數(shù)分別為1.20、1.08、1.06，結(jié)果表明分離的豬胰島細胞具有分泌胰島素的功能。

2.2 DNA、RNA及蛋白水平鑒定

取hCD55豬耳組織樣品DNA為陽性對照，GTKO豬胰島細胞DNA為陰性對照，PCR擴增結(jié)果如圖2A所示，GTKO/hCD55豬胰島細胞基因組上發(fā)生hCD55序列整合。RT-PCR擴增結(jié)果如圖2B所示，在GTKO/hCD55豬胰島細胞上檢測到hCD55信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）表達。流式細胞儀檢測結(jié)果如圖2C所示，WT、GTKO豬胰島細胞上未檢測到hCD55蛋白表達，GTKO/hCD55豬胰島細胞上檢測到hCD55蛋白表達。

圖2 hCD55 DNA、RNA及蛋白水平鑒定Figure 2 Identification of hCD55 DNA, RNA and protein level

2.3 補體依賴的細胞毒性實驗

補體依賴的細胞毒性實驗結(jié)果如圖3所示，在新鮮人血清稀釋比1∶2、1∶4和1∶8條件下，WT與GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞毒性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.05）；在新鮮人血清稀釋比分別為1∶2和1∶4條件下，GTKO與GTKO/hCD55豬胰島細胞毒性比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P＜0.05），而當(dāng)新鮮人血清稀釋比為1∶8時，GTKO與GTKO/hCD55豬胰島細胞毒性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 補體依賴的細胞毒性實驗Figure 3 Complement dependent cytotoxicity test

2.4 人補體沉積檢測

人補體沉積檢測結(jié)果如圖4所示，與WT、GTKO豬胰島細胞相比，GTKO/hCD55豬胰島細胞上人補體C3c和攻膜復(fù)合物C5b-9的沉積均減少，人補體C4c的沉積幾乎不變。

圖4 豬胰島細胞上人補體沉積情況Figure 4 Human complement deposition in pig islet cells

3 討 論

1型糖尿病患病人數(shù)逐年增加，并發(fā)癥嚴重影響患者的生活質(zhì)量，威脅生命安全。胰島移植是治療1型糖尿病合并嚴重并發(fā)癥患者的有效途徑之一。供者來源短缺是胰島移植面臨的一大難題，而豬與人的生理、解剖結(jié)構(gòu)十分相似，可作為異種胰島移植的理想供體，從而解決供體短缺問題。

當(dāng)豬胰島細胞經(jīng)肝門靜脈移植進入受體體內(nèi)后，早期會發(fā)生IBMIR，它是一種復(fù)雜的先天免疫系統(tǒng)的非特異性反應(yīng)，可激活補體、凝血級聯(lián)反應(yīng)和導(dǎo)致中性粒細胞浸潤[31]。對供體進行基因修飾，表達補體調(diào)節(jié)蛋白，有助于減少IBMIR，提高異種胰島細胞的存活率。hCD46是一種具有補體調(diào)節(jié)特性的蛋白，是因子Ⅰ介導(dǎo)的C3b和C4b裂解的唯一普遍表達的輔助因子[32]。van der Windt等[19]將hCD46轉(zhuǎn)基因豬胰島細胞移植給糖尿病模型猴，受體猴脫離外源胰島素最長時間達396 d。hCD55與hCD46都屬于補體調(diào)節(jié)蛋白，但是作用途徑不同。國外研究用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法使得大白豬胰島細胞表達hCD55蛋白，并取得一定效果[33]。體外腺病毒轉(zhuǎn)染方法存在表達不均一、不穩(wěn)定的問題，成都中科奧格生物科技有限公司在GGTA1基因敲除巴馬小型豬耳成纖維細胞的基礎(chǔ)上，利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功建立了Rosa26位點敲入hCD55基因的耳成纖維細胞系[34]。筆者課題組前期研究已使用GTKO新生豬胰島細胞移植到1型糖尿病獼猴進行異種胰島移植，移植物在術(shù)后12周能檢測到特異性豬C肽，且每日平均外源胰島素用量減少[35]。

在此基礎(chǔ)上本研究先對GTKO/hCD55豬胰島細胞上hCD55的表達進行了驗證，然后通過新鮮混合人血清與豬胰島細胞共孵育，采用流式細胞術(shù)檢測補體沉積和細胞毒性情況。結(jié)果顯示3種基因型豬胰島細胞與混合人血清孵育后，胰島細胞毒性與人C3c、C5b-9在豬胰島細胞上的沉積有差異，表明在體外實驗中豬胰島細胞上表達hCD55蛋白有助于抑制補體激活、減少C3c和攻膜復(fù)合物C5b-9的沉積，進而降低細胞毒性。在補體依賴的細胞毒性實驗中，新鮮混合人血清稀釋比分別為1∶2、1∶4、1∶8時，WT與GTKO豬胰島細胞毒性差異顯著，表明敲除αGal抗原有助于減少細胞死亡；新鮮混合人血清稀釋比分別為1∶2、1∶4時，GTKO/hCD55與WT、GTKO豬胰島細胞毒性差異顯著，說明與GTKO基因型比較，GTKO/hCD55基因型在減少豬胰島細胞死亡的效果方面進一步發(fā)揮了保護作用。但是當(dāng)新鮮混合人血清稀釋比為1∶8時，GTKO與GTKO/hCD55豬胰島細胞毒性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有可能是因為當(dāng)人血清稀釋比為1∶8時血清中的人補體成分較少，GTKO、GTKO/hCD55豬胰島細胞與人補體成分接觸不夠所導(dǎo)致的。由于豬胰腺細胞外基質(zhì)蛋白相比于鼠、犬、人胰腺細胞外基質(zhì)蛋白表達較弱，尤其是在胰島周圍[36]，豬胰腺相對于其他物種的胰腺更容易被消化，在分離的過程中對溫度與中止消化的時間更加敏感，分離難度更大，且豬的年齡不僅決定了胰腺的可分離性，也決定了胰島的體內(nèi)、體外生理功能[37]，因此本研究選用18月齡及以上成年豬。本研究證實豬胰島細胞上表達hCD55蛋白在體外實驗中能夠發(fā)揮保護作用，但移植到受體體內(nèi)所發(fā)揮的作用仍需進一步驗證。

綜上所述，本文成功分離得到具有胰島素分泌功能的豬胰島細胞，完成hCD55的DNA、RNA和蛋白水平鑒定，在新鮮混合人血清孵育條件下，通過補體依賴的細胞毒性實驗和人補體沉積檢測，驗證了hCD55蛋白在豬胰島細胞上所發(fā)揮的補體保護效果，這為hCD55在異種胰島移植中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。