潰瘍性結腸炎患者骨質流失的危險因素及與糞便菌群的關系

冉 艷，白 潔 ，李培杰，米 琛 ，厲英超

（1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科，陜西西安 710061；2. 陜西省人民醫(yī)院消化內二科，陜西西安 710068）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease, IBD）是一類慢性非特異性的炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis, UC）和克羅恩?。–rohn’s disease, CD）兩種亞型。近年來，隨著工業(yè)化及全球化進程，IBD 已成為一種全球性疾病，在中國等許多亞洲國家中的發(fā)病率也呈現上升的趨勢[1-2]。目前研究發(fā)現，IBD 不僅累及消化道，還可影響許多腸外器官或組織，引起脊柱關節(jié)病、骨質流失、原發(fā)性硬化性膽管炎等多種腸外表現或腸外并發(fā)癥[3-4]，因此被認為是一種全身性疾病。

骨質流失被認為是IBD 患者中一種十分常見的腸外并發(fā)癥。根據嚴重程度可將骨質流失分為骨量減少和骨質疏松[5]，嚴重骨質疏松的患者容易出現骨折，骨折可能會進一步引起感染、栓塞、褥瘡、墜積性肺炎等多種并發(fā)癥[6]，這不僅嚴重影響了患者的生活質量，也給家庭和社會帶來了巨大的經濟壓力和醫(yī)療負擔。但是，目前人們對IBD 患者骨質流失的認識不夠充分，對其危害也不夠重視，IBD 患者骨質流失的危險因素、發(fā)病機制及規(guī)范診治仍缺乏大量循證醫(yī)學證據。因此，開展IBD 患者骨質流失的危險因素及其與糞便菌群的關系研究非常必要，不僅可以了解IBD 患者骨質流失的流行病學特征，還對探索IBD 患者骨質流失的發(fā)病機制和新型治療意義重大。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020 年1 月至2020 年6 月就診于西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科的UC 患者為研究對象。納入標準：根據2018 年中華醫(yī)學會消化病學分會炎癥性腸病治療組確立的《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》[7]，納入符合診斷標準的成年UC 患者。排除標準：①患有CD、腸結核、艾滋病腸病、腸道白塞病、結直腸癌等其他腸道疾病者；②患有心腦血管疾病、支氣管哮喘、肝硬化、惡性腫瘤等嚴重疾病者；③患有其他可引起骨代謝異常的疾病者，如甲狀腺功能亢進癥、甲狀旁腺功能亢進癥、慢性腎衰竭等；④靜脈或口服使用糖皮質激素者，確診UC 前已有骨質疏松或骨折者；⑤1 個月以內使用抗生素及益生菌者；⑥孕產婦及近期有生育計劃的女性。

1.2 研究流程

1.2.1 問卷調查 由經過專業(yè)培訓的醫(yī)務人員對納入的UC 患者進行問卷調查，以保證數據的準確性。收集患者基本信息及相關臨床資料，并采用蒙特利爾分型、改良Truelove &Witts 分型、改良的Mayo 評分來判定UC 患者的病變范圍、疾病嚴重程度及疾病的活動性。

1.2.2 收集相關血清學指標 收集骨代謝及炎癥相關指標。骨代謝相關指標包括血鈣、血磷、甲狀旁腺激素、血清25-羥維生素D，炎癥相關指標C 反應蛋白（C-reactive protein, CRP）、紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）。

1.2.3 骨密度測定 為減少個體間誤差，本研究均采用西安交通大學第一附屬醫(yī)院雙能X 線骨密度儀（LEXXOS-LX381，法國 DMS），測定患者腰椎（L1-L4）及股骨頸骨密度。依據《中國老年骨質疏松癥診療指南》[8]，本研究將骨量減少和骨質疏松統稱為骨質流失，腰椎和股骨頸任何一個部位的骨密度符合骨量減少/骨質疏松的診斷標準，即診斷為骨質流失。

1.2.4 糞便標本采集 患者排便后，盡快用無菌取樣勺挖取量約10g 的新鮮糞便，放入清潔干燥的無菌凍存管內，對標本進行編號，轉運至-80 ℃超低溫冰箱內凍存，避免標本反復凍融。

1.2.5 糞便菌群DNA 提取、16S rDNA PCR 擴增及產物純化 取所收集的UC 患者糞便標本，于室溫下緩慢解凍、融化，提取糞便標本DNA。以341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 806R（5′-GGA CTACHVGGGTATCTAAT-3′）為引物，對糞便菌群16SrDNA 的V3-V4 高變區(qū)進行兩次PCR 擴增，使用AMPure XP Beads 對PCR 擴增產物進行純化，并進行定量。

1.2.6 糞便菌群16S rDNA 高通量測序 對糞便菌群16S rDNA 序列的V3-V4 高變區(qū)進行高通量測序分析，使用Omicsmart 數據分析平臺進行多樣性、物種組成及代謝通路分析。

1.3 統計學方法及測序結果分析

采用SPSS 25.0 軟件對相關數據進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較；計數資料以例數和百分比表示，采用Fisher 精確檢驗和非參數檢驗進行組間比較。使用基迪奧生物Omicsmart 數據分析平臺對UC 患者糞便菌群進行多樣性、物種組成以及代謝通路分析。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 單因素分析

本研究對比了性別、年齡等基本資料，臨床分型、疾病分期等臨床資料及血鈣、25-羥維生素D 濃度等相關血清學指標在骨量正常組與骨質流失組之間的差異。結果顯示：骨量正常組與骨質流失組UC 患者之間性別、年齡、發(fā)病年齡、病程、體質量指數均無統計學差異；慢性復發(fā)型患者骨質流失的發(fā)生率明顯高于初發(fā)型患者（P=0.047），隨疾病嚴重程度加重，UC患者骨質流失的發(fā)生率增加（P=0.016），兩組之間疾病分期、病變范圍、疾病活動性無統計學差異；骨量正常組患者血鈣、25-羥維生素D 濃度明顯高于骨質流失組患者（P＜0.05），而兩組之間血磷、甲狀旁腺激素濃度及CRP、ESR 水平均無統計學差異（表1）。

表1 骨量正常組與骨質流失組相關指標的比較Tab. 1 Differences between the normal group and the bone loss group

2.2 糞便菌群16S rDNA 測序分析結果

2.2.1 多樣性分析

2.2.1.1α多樣性分析：Shannon 指數和 Simpson 指數可綜合體現物種的豐富度和均勻度，常用于反映物種α多樣性。從圖1 可以看出，骨質流失組的Shannon指數和Simpson 指數均低于骨量正常組，表明骨質流失組糞便菌群的α多樣性減低，但經統計學檢驗，兩組之間α多樣性的差異無統計學意義（P=0.333）。

圖1 骨量正常組與骨質流失組Shannon 指數和Simpson指數條形圖Fig.1 Shannon and Simpson indexes of the normal group and the bone loss group

2.2.1.2β多樣性分析：β多樣性指的是樣本間多樣性 ，常 用 PCoA、NMDS 來 反 映 。 PCoA 分 析 和NMDS 分析以散點圖的形式來展現不同樣本和不同分組的分布特征，樣本之間的距離越近，表示樣本菌群結構的相似程度越大。如圖2 所示，同組內樣本相互聚集，而不同組間的樣本呈現分離趨勢，這表明同組內樣本的菌群相似程度較大，而兩組間樣本的菌群差異程度較大，兩組之間糞便菌群的β多樣性具有統計學差異。

圖2 骨量正常組與骨質流失組糞便菌群的PCoA 分析和NMDS 分析Fig. 2 PCoA and NMDS analyses of fecal microbiota in the normal group and the bone loss group

2.2.2 物種組成分析 對骨量正常組和骨質流失組的糞便菌群在不同水平上進行物種組成分析。如圖3 所示，在門水平上，骨質流失組糞便菌群中厚壁菌門豐度下降（70.8%vs.49.3%,P=0.001），而變形菌門豐度上升（10.0%vs.31.8%,P=0.044）；在綱水平上，骨質流失組糞便菌群中γ-變形桿菌綱豐度上升（10.0%vs.31.3%,P=0.046）；在目水平上，骨質流失組糞便菌群中腸桿菌目豐度上升（7.4%vs.29.5%,P=0.044）；在科水平上，骨質流失組中腸桿菌科豐度上升（7.4%vs.29.5%,P=0.044），而毛螺菌科（22.0%vs.9.9%,P=0.040）和乳桿菌科（4.9%vs.0.9%,P=0.030）豐度下降；在屬水平上，骨質流失組中埃希氏菌屬豐度上升（1.9%vs.25.8%,P=0.011），而乳桿菌屬豐度下降（4.8%vs.0.8%,P=0.032）；在種水平上，骨量正常組與骨質流失組糞便菌群的物種組成無統計學差異。

圖3 不同水平的物種組成堆疊圖Fig.3 Stacking diagrams of species composition at different levels

2.2.3 菌群代謝通路分析 骨量正常組與骨質流失組之間菌群代謝通路具有明顯差異。經過與KEGG 數據庫比對，骨質流失組在志賀菌、香葉醇的降解、類固醇激素的合成、細菌侵襲上皮細胞及青霉素和頭孢菌素的生物合成等信號通路上的功能豐度明顯上升。

3 討 論

骨質流失在UC 患者中具有較高的發(fā)生率，這與既往大多數研究的結論一致[9-11]。UC 患者出現骨質流失的風險明顯高于普通人群，這提示需要特別關注UC 患者的骨骼健康問題。許多研究表明，女性較男性更易出現骨質流失，尤其是絕經后女性，這可能與雌激素等多種因素有關[12-13]。本研究中男性UC 患者骨質流失的發(fā)生率高于女性（73.3%vs.44.4%），但二者間的差異無統計學意義。本研究排除了合并有心腦血管疾病、惡性腫瘤等疾病的患者，而這些多為增齡性疾病。因此，本研究納入的患者多為青中年人[所有患者的平均年齡為（39.1±12.5）歲]，這些年齡范圍內的女性患者尚未進入圍絕經期，雌激素對女性具有明顯的保護作用。因此，本研究中女性患者骨質流失的發(fā)生率較男性患者低。

慢性復發(fā)型、活動期、病變范圍較廣、嚴重程度較重的UC 患者發(fā)生骨質流失的風險會有所增加，這可能與慢性病程、活動期炎癥重、腸黏膜對營養(yǎng)物質的吸收嚴重減少等原因有關[14-15]。本研究發(fā)現，UC 患者骨質流失的發(fā)生率與臨床分型及疾病嚴重程度有關，但未發(fā)現與疾病分期、病變范圍、疾病活動性有明顯關聯。

骨質流失組UC 患者血鈣和25-羥維生素D 濃度較骨量正常組明顯減低，這與許多研究的結論一致，表明了鈣和維生素D 對骨骼健康的重要性。但也有研究表明，補充鈣和維生素D 無法降低骨折的發(fā)生率，鈣和維生素D 與IBD 患者骨密度之間缺乏明確的相關性[16-17]。目前有關鈣和維生素D 能否降低骨質疏松及骨折風險仍存在一定爭議，仍需進行更深入的研究。本研究僅收集了基線水平時的骨代謝指標及骨密度數據，未對患者進行干預及治療后隨訪，未來可在補充鈣和維生素D 后復查骨代謝指標和骨密度，以明確補充鈣和維生素D 能否改善UC 患者的骨密度。

本研究未發(fā)現CRP、ESR 與UC 患者骨質流失具有明顯關聯。CRP 和ESR 均為非特異性炎癥指標，因而它們在評估IBD 患者炎癥活動性中的價值比較有限[18]。除 CRP、ESR 之外，TNF-α、IL-6 等炎癥細胞因子的水平也可反映IBD 患者的炎癥活動性。TNF-α 等細胞因子與IBD、類風濕關節(jié)炎等疾病的發(fā)生有關。有研究表明，使用英夫利西單抗有利于改善IBD 患者、類風濕關節(jié)炎患者的骨質流失[19-20]，這不僅從側面反映了炎癥細胞因子在骨質流失中的致病作用，也表明抗TNF-α 制劑可以作為一種抗骨質流失的有效手段。進一步可以測定血清中TNF-α、IL-6 等炎癥細胞因子的水平，研究其與UC 患者骨質流失間的相關性，為預測UC 患者骨質流失的風險以及作為一種有效治療靶點提供可靠的依據。

骨質流失組糞便菌群的α 多樣性減低，但兩組間差異無統計學意義。兩組之間β 多樣性存在統計學差異，且物種組成在門、綱、目、科、屬水平上均具有統計學差異。與骨量正常UC 患者相比，骨質流失UC患者糞便菌群多樣性減低更明顯，且菌群失調更嚴重。本研究表明，腸道菌群的組成及功能與骨質流失的發(fā)生發(fā)展密切相關，這與許多動物實驗及人群研究的結論一致[21-26]。研究發(fā)現，與健康人群相比，骨質疏松患者的腸道菌群豐富度和多樣性降低，且腸道菌群在門和屬水平上的物種組成均存在明顯差異[21,25]。動物實驗還發(fā)現，補充鼠李糖乳桿菌等益生菌可明顯改善小鼠的骨質流失[27]，這表明益生菌可能對骨質流失具有一定的治療作用。因此，可以推測，乳桿菌等益生菌減少可能對UC 患者的骨質流失具有致病作用，而補充益生菌可能對UC 患者骨質流失具有治療作用。

相關宏基因組學研究發(fā)現，腸道菌群是通過代謝和免疫途徑參與了骨質疏松的發(fā)生發(fā)展過程[24,26]。本研究發(fā)現，兩組患者腸道菌群的許多代謝通路都存在明顯差異，骨質流失UC 患者中志賀菌、香葉醇的降解、類固醇激素的合成等通路表達豐度明顯升高。志賀菌代謝通路的差異進一步表明了糞便菌群在UC 患者骨質流失中的重要作用。同時，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用的香葉醇有望通過改善腸道炎癥、減輕免疫炎癥反應[28-30]，從而改善骨質流失。骨質流失是糖皮質激素的常見藥物不良反應之一[31]，類固醇激素的合成通路表達豐度升高與其在骨質流失中的致病作用相一致。這些具有明顯差異的代謝通路有助于闡明腸道菌群參與骨質流失的病理機制，也有望成為治療骨質流失的突破口，但目前相關研究依然較少，這些復雜的基因、代謝網絡仍有待進一步挖掘，才能對闡明致病機制和開拓新型治療方法提供嚴謹可靠的理論依據。

本研究是一項回顧性臨床研究，盡管具有樣本量較少、未設立健康對照組、未進行干預和隨訪等局限性，但本研究發(fā)現，UC 患者骨質流失與臨床分型、疾病嚴重程度及鈣和維生素D 濃度有關，同時也發(fā)現其與糞便菌群密切相關，這為探索UC 患者骨質流失的發(fā)病機制和開拓新型治療方法提供了新思路。根據初步探索得到的研究結論，我們可以進一步擴大樣本量，設立健康對照組，對患者進行干預及隨訪，還可以對有望用于防治骨質流失的藥物（如益生菌、香葉醇等）進行療效及安全性評估，并對藥物組成、給藥劑量和治療療程進行優(yōu)化，為UC 患者骨質流失的治療提供更多的可能性。