寬口裂腹魚的人工催產、胚胎發(fā)育及早期仔魚發(fā)育觀察

夏子惠，趙賀，邱夢，聶竹蘭，陳克迅，李學濤，秦曉芳，魏杰

(塔里木大學 動物科學與技術學院，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，省部共建塔里木盆地生物資源保護利用國家重點實驗室,新疆 阿拉爾 843300)

近年來，新疆維吾爾自治區(qū)部分流域資源遭到過度捕撈，魚類洄游路線被水利設施阻隔，由于特殊的地理位置和經濟文化特點，該流域還面臨著物種入侵、全球氣候變化等更嚴峻的生態(tài)問題[1-2]。新疆沙漠地區(qū)生態(tài)環(huán)境脆弱，高原地區(qū)植被覆蓋率小、生產力低下，部分河流來源于冰山融水且缺乏營養(yǎng)物質，導致新疆水生生態(tài)更容易受到外界的影響[3]。魚類生活在脆弱的生境中，一旦魚類資源遭到破壞，恢復過程將會十分緩慢[4-6]。

寬口裂腹魚Schizothoraxeurystomus隸屬于鯉形目Cypriniformes鯉科Cyprinidae裂腹魚亞科Schizothoracinae裂腹魚屬Schizothorax，是新疆克孜勒河土著魚之一[7]。水利水電設施的修建使得寬口裂腹魚棲息地受到破壞[8]，數量急劇下降，因此，保護寬口裂腹魚資源迫在眉睫。目前，對寬口裂腹魚的研究主要集中在簡單分類及地理分布[9-11]、線粒體DNA測序[12]、親緣關系[13-15]等方面，而關于寬口裂腹魚人工繁殖和早期發(fā)育的研究尚未見報道。本研究中,使用魚腦垂體(pituitary gland,PG)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)和促黃體生成素釋放激素A2(luteinizing hormone releasing hormone A2,LHRH-A2)對寬口裂腹魚進行人工催產，采用Box-Benhnken響應面分析法，建回歸模型并進行顯著性檢驗，比較不同劑量外源激素組合誘導寬口裂腹魚親魚產卵的效果，篩選出最佳催產劑用量配比，并系統觀察了寬口裂腹魚的胚胎和早期仔魚的發(fā)育生長過程，旨在豐富寬口裂腹魚的早期生活史和繁殖生物學資料，并為寬口裂腹魚的資源保護、人工繁育和增殖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年4—5月在新疆維吾爾自治區(qū)克孜勒蘇柯爾克自治州烏恰縣卡拉貝利水利樞紐工程魚類增殖放流站進行寬口裂腹魚人工繁殖試驗。試驗親魚于2017—2018年捕自克孜勒河流域，共捕親魚1 478尾，體長為 135.69～302.15 mm，體質量為 93.26～317.22 g。

1.2 方法

1.2.1 人工繁殖試驗時間、地點 將試驗親魚暫養(yǎng)于圓形塑料桶 (直徑為2 m，深度為1 m)中，15 d后轉移至土池塘 (667 m2)中進行流水培育。親魚培育過程中全程投喂斯特佳生物活性飼料T3 (主要原料為高蛋白魚粉、南極蝦粉、酵母細胞壁、魚溶蛋白、螺旋藻和卵磷脂等)，日投餌率為2%～5%。選擇3～5齡雄性寬口裂腹魚親魚和4～6齡雌性寬口裂腹魚親魚進人工繁殖試驗。

1.2.2 人工催產

1)親魚培育。試驗用健康雌魚960尾，進行為期2月的強化培育，使用斯特佳生物活性飼料T3配合冰凍搖蚊幼蟲進行投喂，水溫維持在14.0～15.0 ℃，增大水流刺激，使試驗雌魚均達到相近的性腺成熟期。其中，雌魚形體明顯大于雄魚，臀鰭較肥厚，腹部膨大柔軟，體表顏色相對雄魚較淺；雄魚鰭條及身體顏色較鮮艷，臀鰭呈斜三角且末端為尖形，形體修長，輕壓腹部有少量白色精液流淌出。

2)催產藥物復合調控試驗。采用顯著性檢驗和響應面法，探索PG、HCG和LHRH-A2(均產自寧波第二激素廠)3種藥物對寬口裂腹魚催產效果的復合調控作用。首先進行預試驗，確定PG用量范圍為5～25 mg/kg，HCG用量范圍為100～900 IU/kg，LHRH-A2用量范圍為10～30 μg/kg。進行3種催產藥物復合調控試驗時，采用3因素3水平的Box-Benhnken試驗設計，因子水平分別為-1、0、1，試驗組共17個，每組設置3個重復，每個重復10尾雌魚。

根據試驗結果擬合寬口裂腹魚催產率與PG、HCG和LHRH-A2因素間的多元線性回歸方程，并計算最佳催產藥物組合及理論催產率。根據篩選出的最佳催產藥物濃度進行實際注射，設置3個試驗組，每組10尾雌魚，計算實際催產率，與理論催產率進行對比，驗證最佳催產藥物組合是否合理。

3)催產及人工授精。所有雌魚進行催產時均采用胸鰭基部二次注射，第1針注射總量的1/5，等待12 h后，將剩下的4/5藥量全部進行注射。整個試驗用水為經過循環(huán)系統過濾的地下水，水溫為(16.5±0.5)℃，pH為8.29～8.36，溶解氧為5.9～6.5 mg/L，鹽度為16～17，氨氮<0.1 mg/L。

采用干法人工授精，將成熟的魚卵直接擠入干燥的孵化筐(0.50 m×0.40 m×0.35 m)中，再將雄魚的精液直接擠到卵子上，用鵝毛輕輕攪動使二者充分混合。2 min后加入適量清水，受精卵吸水膨脹，25 min后再用清水清洗受精卵，將受精卵均勻鋪放在孵化筐中，并放入孵化池 (5.00 m×0.45 m×0.50 m)中，采用淋浴平列槽式孵化法進行孵化，溶解氧≥5.0 mg/mL。

4)受精卵最佳孵化水溫試驗。為確定受精卵孵化最佳水溫，在10.0～20.0 ℃水溫下設置11個梯度水溫試驗，每組間隔為1.0 ℃，用溫控加熱棒控溫，每個溫度組設置3個重復，每個重復的受精卵為500粒。

1.2.3 胚胎發(fā)育和早期仔魚發(fā)育觀察 選取同批次50粒受精卵進行胚胎發(fā)育觀察研究，利用SMZ 1270數碼體式顯微鏡觀察受精卵各發(fā)育時期，以70%的受精卵進入相同發(fā)育時期作為一個發(fā)育期的判定；選取同批次受精卵發(fā)育出膜的仔魚用于早期仔魚發(fā)育觀察，每次至少選取5尾仔魚，采用體積分數為10%的福爾馬林溶液固定，在顯微鏡下進行觀察并記錄。

1.2.4 繁殖效率評價 寬口裂腹魚催產率(%)、受精率(%)和孵化率(%)計算公式為

催產率=產卵總數/催情總數×100%，

受精率=原腸中期活卵數/產卵總數×100%，

孵化率=魚苗水花數/受精卵總數×100%。

1.3 數據處理

卵徑及各發(fā)育階段的仔魚全長數據以平均值±標準差 (mean±S.D.)表示。篩選不同催產藥物及雌雄比對催產率的影響，以及不同水溫對孵化率影響時，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 催產藥物復合調控試驗

響應面試驗設計方案及結果見表1。寬口裂腹魚催產率 (Y)與PG (A)、HCG (B)和LHRH-A2(C)因素間的多元線性回歸方程為

表1 響應面試驗方案及結果Tab.1 Design and results of response surface experiment

Y=-6.25A2-18.755B2+1.66C2+6.67AB+

2.50AC+5.83BC-21.33A-6.33B-

15.50C+56.00。

采用響應面法對催產劑量和催產率之間的關系進行三維響應面分析。如圖1(a)所示，隨著HCG劑量的增加，催產率明顯降低，隨著PG劑量的增加，催產率逐漸提高到最大，然后呈現下降趨勢。在x-y面的投影等高線顯示，沿HCG軸等高線變化密集且等高線呈橢圓形，說明兩因素交互作用較強，結果與表2所示一致。

如圖1(b)所示，隨著PG和LHRH-A2用量的逐漸增加，催產率出現先上升后下降的趨勢，等高線呈圓形，說明兩因素交互作用一般，影響不顯著，結果與表2所示一致。如圖1(c)所示，隨著HCG用量逐漸增加，催產率整體呈現下降趨勢，隨著LHRH-A2用量增加，催產率緩慢下降。

表2 催產率的方差分析Tab.2 Variance analysis of extraction yield of success rate

響應模型的優(yōu)化結果顯示，PG為10.27 mg/kg、HCG為300.00 IU/kg和LHRH-A2為19.41 μg/kg時，寬口裂腹魚催產率理論值最高，為73.67%。經過試驗驗證，在此最優(yōu)催產藥物濃度下，寬口裂腹魚的催產率為 76.67%±0.06%，試驗結果與理論催產率基本相符，說明響應模型方程建立成功，可有效預測寬口裂腹魚的催產率。

2.2 適宜孵化水溫

從圖2可見：溫度對寬口裂腹魚孵化率有顯著性影響，當水溫為16.0 ℃時，受精卵孵化率高達96.32%；水溫為17.0 ℃時，孵化率可達96.18%；溫度低于16.0 ℃或高于17.0 ℃時，孵化率顯著下降 (P<0.05)，因此，其最適孵化水溫為16.0～17.0 ℃。

圖2 孵化率隨水溫的變化Fig.2 Change in hatching rate with water temperature

2.3 寬口裂腹魚胚胎發(fā)育

寬口裂腹魚胚胎發(fā)育過程可劃分為胚盤、卵裂、囊胚、原腸胚、神經胚、器官形成和出膜7個階段。整個發(fā)育過程可劃分為胚盤期、卵裂期、囊胚期、原腸期、卵黃栓期、神經胚期、胚孔封閉期、肌節(jié)出現期、眼囊期、尾芽期、晶體出現期、肌肉效應期、心臟原基期、耳石期、尾鰭原基期、心臟搏動期、胸鰭原基形成期和出膜期18個時期(表3，圖3)。寬口裂腹魚受精卵在水溫 (16.19±0.08)℃時，受精卵發(fā)育經過145 h 48 min孵化，總積溫為2 364.80 ℃·h。

表3 寬口裂腹魚胚胎發(fā)育時序Tab.3 Temporal sequence of embryonic development in Schizothorax eurystomus

2.4 寬口裂腹魚早期仔魚發(fā)育

早期仔魚發(fā)育分為眼球色素出現期、體色素出現期、鰾充氣期和卵黃囊完全吸收期4個時期 (表4，圖4)。仔魚生長溫度為(17.88±0.44)℃，出膜312 h后，仔魚開始攝取開口餌料豐年蟲。待到出膜480 h后仔魚卵黃囊消耗完全，全長為 (20.17±0.96)mm，依靠外源性營養(yǎng)存活時，投喂海大集團淡水魚膨化配合飼料6602系列漂浮料和五龍飼料有限公司的甲魚配合飼料，于每天9∶30、14∶30和19∶30分別進行投喂，將飼料分批次潑灑，直至幼魚不攝食為止。

表4 寬口裂腹魚早期仔魚發(fā)育觀察Tab.4 Observation of early larval development of Schizothorax eurystomus

經過回歸分析，寬口裂腹魚早期仔魚的全長生長方程為y=8.329e0.002x(R2=0.969 7，0≤x≤480，n=80)，其中y為仔魚全長(mm)，x為出膜時間(h)，n為樣本數 (圖5)。

圖5 寬口裂腹魚早期仔魚的生長(n=80)Fig.5 Growth of early larval Schizothorax eurystomus(n=80)

3 討論

3.1 催產藥物和劑量對催產效果的影響

性腺發(fā)育與生存環(huán)境、營養(yǎng)積累有著密切的關系，若投喂飼料營養(yǎng)和數量不足，親魚的性腺就無法正常發(fā)育[16-17]。寬口裂腹魚親魚催產前，需投喂高蛋白質餌料進行親魚的強化培育，為親魚發(fā)育打下基礎。在實際生產中，根據親魚的發(fā)育情況，催產藥物可以選擇一次注射或者二次注射。發(fā)育較好的親魚可進行一次注射，發(fā)育較差的親魚和初產魚則必須進行二次或二次以上注射[18]。

響應面法是一種高效便捷的統計方法，具有周期短、擬合方程精度高、預測效果好等優(yōu)點。響應面法將試驗設計與數學建模相結合，通過對具有代表性的局部各點進行試驗，回歸擬合因素和響應值的函數關系，快速建立數學模型，縮短優(yōu)化時間并提高應用可信度。通過對函數響應面和等高線的分析，可對各因素水平及其交互作用進行優(yōu)化并確定多因素系統的最佳條件[19]，本研究中采用響應面法來優(yōu)化寬口裂腹魚的催產藥物方案。

本試驗中以催產率為衡量指標，從整體角度評價了寬口裂腹魚人工催產技術，在預試驗基礎上,采用響應面法篩選PG、HCG和LHRH-A2的最優(yōu)用量組合，最終得到寬口裂腹魚人工催產的最佳藥物用量組合為PG 10.27 mg/kg、HCG 300.00 IU/kg和LHRH-A219.41 μg/kg，這為寬口裂腹魚有效催產提供了基礎數據。不同催產劑在實際生產過程中存在一個最佳配比。本研究中僅以PG、HCG和LHRH-A2為研究對象篩選其最佳配比，而魚類的人工催產藥物不少于8種[18]，因此，還有較多催產劑組合使用有待于進一步探究。

A—受精卵；B—胚盤期；C—2細胞期；D—4細胞期；E—8細胞期；F—16細胞期；G—32細胞期；H—64細胞期；I—多細胞期；J—囊胚早期；K—囊胚中期；L—囊胚后期；M—原腸早期；N—原腸中期；O—原腸后期；P—卵黃栓期；Q—神經胚期；R—胚孔封閉期；S—肌節(jié)出現期；T—眼囊期；U—尾芽期；V—晶體出現期；W—肌肉效應期；X—心臟原基期；Y—耳石期；Z—尾鰭原基期；α—心臟搏動期；β—胸鰭原基形成期；γ—出膜期；δ—初孵仔魚。A—fertilized egg；B—blastodisc stage；C—2-cell stage；D—4-cell stage；E—8-cell stage；F—16-cell stage；G—32-cell stage；H—64-cell stage；I—multicellular stage；J—early-blastula stage；K—mid-blastula stage；L—late-blastula stage；M—early-gastrula stage；N—mid-gastrula stage；O—late-gastrula stage；P—yolk plug stage；Q—neurula stage；R—blastopore closing stage；S—appearance of myomere；T—optic vesicle；U—tail bud；V—formation of eye lens；W—muscular effect；X—heart rudiment；Y—appearance of otolith；Z—appearance of caudal fin；α—heart beating；β—pectoral fin；γ—hatching；δ—newly hatched larva.圖3 寬口裂腹魚的胚胎發(fā)育Fig.3 Embryonic development of Schizothorax eurystomus

A、B—眼球色素出現期；C、D—體色素出現期；E、F—鰾充氣期；G—卵黃囊完全吸收期。A,B—eye pigmentation increasing period；C,D—body pigmentation increasing period；E,F—air bladder inflation period；G—yolk sac complete absorption.圖4 寬口裂腹魚的早期仔魚發(fā)育Fig.4 Larval development of Schizothorax eurystomus

目前，裂腹魚類催產所用激素種類和劑量各不相同。曾本和等[20]采用DOM(5 mg/kg)+LHRH-A2(5 μg/kg)催產藥物組合，取得拉薩裂腹魚S.waltoni全人工繁殖成功；許勇[21]采用LHRH-A2(15 μg/kg)+PG(1.2 mg/kg)+HCG(1 000 IU/kg)藥物組合催產長絲裂腹魚S.dolichonema，取得了預期的催產效果；甘維熊等[22]采用PG(3 mg/kg)+LHRH-A2(12 μg/kg)催產藥物組合，對雅礱江短須裂腹魚S.wangchiachi催產，取得了良好效果。推測催產藥物的復合使用是提高裂腹魚亞科魚類排卵率的有效方法。

3.2 催產親魚死亡率高的原因分析

寬口裂腹魚在人工繁殖后親魚死亡率較高。寬口裂腹魚人工催產后，效應期前需定期對其進行檢查，在這期間親魚會產生比較強烈的應激反應并可導致其損傷，這是親魚產后死亡的主要原因之一[23]。因此，在生產過程中，可以先用藥物對親魚進行麻醉，減少親魚產生應激，并適當減少檢查的次數，可保證親魚成活率。催產后的寬口裂腹魚應盡快放入高溶氧、緩流水的養(yǎng)殖池中，等其體質恢復后，再放入土池塘中進行飼養(yǎng)。本試驗中所用寬口裂腹魚全部捕自天然河流克孜勒河，野性較強，這對親魚的成活和再利用均有一定難度。同時，由于寬口裂腹魚性成熟晚，棲息水域水溫較低，生長速度慢，親魚絕對懷卵量少，故進行規(guī)模化寬口裂腹魚苗種生產時，需要相對較多的性成熟親魚。因此，加強對野生寬口裂腹魚產后親魚的馴化培育，促使親魚在人工飼養(yǎng)條件下能夠順利達到性成熟，進而開展人工養(yǎng)殖的基礎性研究，是實現寬口裂腹魚人工規(guī)?；缟a，保護和開發(fā)其種質資源的根本措施。如何有效提高野生魚類人工催產后的成活率，亟待進一步深入研究。寬口裂腹魚為國家瀕危保護魚類，野外種質資源十分稀少，人工繁殖又需要捕撈野生親魚，這將對野生種群造成極大破壞[17]。因此，有效地提高親魚的催產率和產后成活率，對寬口裂腹魚資源保護具有重大意義。

3.3 寬口裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的胚胎發(fā)育差異

將寬口裂腹魚與短須裂腹魚[22]、厚唇裸重唇魚Gymnodiptychuspachycheilus[24]、長絲裂腹魚S.dolichonema[25]、光唇裂腹魚S.lissolabiatus[26]、伊犁裂腹魚S.pseudaksaiensis[27]、塔里木裂腹魚S.biddulphi[28]和扁吻魚Aspiorhynchuslaticeps[29]等其他裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育進行比較(表5)，裂腹魚亞科魚類胚胎孵化溫度均不超過22 ℃，這是由于裂腹魚亞科是棲息在高海拔和低溫水域環(huán)境中的冷水性魚類，所以其繁殖發(fā)育水溫也相對較低。寬口裂腹魚胚胎發(fā)育用時長于伊犁裂腹魚、塔里木裂腹魚和扁吻魚，而短于短須裂腹魚、厚唇裸重唇魚、長絲裂腹魚和光唇裂腹魚，孵化水溫和魚類品種不同可能是造成胚胎發(fā)育用時存在差異的原因。寬口裂腹魚的受精卵卵徑為(2.50±0.24)mm，在幾種裂腹魚亞科魚類中屬于較大類型，卵徑是反映生物生活史進化過程的一個重要生物學特征，其大小與環(huán)境相關，是魚類長期適應環(huán)境的結果[30]。較大卵徑在一定程度上彌補了寬口裂腹魚孵化時間長帶來的存活壓力[5，31-32]。出膜階段時，寬口裂腹魚和厚唇裸重唇魚處于胸鰭原基形成期，短須裂腹魚、光唇裂腹魚和伊犁裂腹魚處于心臟搏動期，長絲裂腹魚處于心臟原基期，塔里木裂腹魚處于肌肉效應期，扁吻魚處于血液循環(huán)期。寬口裂腹魚在胚胎發(fā)育過程中心臟、血液循環(huán)、尾鰭原基和胸鰭原基均在孵化出膜前形成，這有利于仔魚更好地適應高原貧營養(yǎng)及低水溫環(huán)境[27]。寬口裂腹魚、短須裂腹魚和伊犁裂腹魚出膜方式均為尾部先出膜，厚唇裸重唇魚、光唇裂腹魚和扁吻魚均為頭部或尾部先出膜，出膜方式可能與魚的種類有關。

表5 寬口裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類胚胎發(fā)育特點比較Tab.5 Comparison of the embryonic developmental characteristics between Schizothorax eurystomus and other members in Schizothoracinae fish

3.4 寬口裂腹魚與其他裂腹魚亞科魚類的仔魚發(fā)育差異

本研究中，寬口裂腹魚初孵仔魚全長大于伊犁裂腹魚、塔里木裂腹魚和扁吻魚，小于短須裂腹魚、厚唇裸重唇魚、長絲裂腹魚和光唇裂腹魚(表5)，估測寬口裂腹魚初孵仔魚在裂腹魚亞科中屬于中等類型。推測寬口裂腹魚由于是中等體型，可以避免因體型太小而被捕食，或者因體型過大而消耗更多能量從而需要不停游動覓食的情況發(fā)生[33]。寬口裂腹魚仔魚出膜后20 d后卵黃囊才消耗殆盡，時間均長于其他裂腹魚。魚類營養(yǎng)方式從內源性向外源性轉換時，由于各種原因會造成極高的死亡率，寬口裂腹魚較長的卵黃囊吸收時間，是對低溫環(huán)境長期適應的結果[34]，但關于寬口裂腹魚卵黃囊確切的發(fā)育機制有待進一步研究。

3.5 寬口裂腹魚早期發(fā)育與環(huán)境適應性

本研究中，寬口裂腹魚采自克孜勒河，平均海拔4 000 m以上，水源是天山南脈中吉邊界西側吉爾吉斯斯坦境內扎爾多布卡山口的冰山融水，水體中營養(yǎng)物質少，流域內生境貧瘠[35]。寬口裂腹魚卵徑和卵黃較大，含有豐富的營養(yǎng)物質，有利于減輕寬口裂腹魚的攝食壓力。生物個體在長期進化中形成了個體發(fā)育機制和生存策略，為了適應環(huán)境，生物個體會優(yōu)先發(fā)育主要器官[36]。寬口裂腹魚胚胎孵化溫度較低，發(fā)育過程中器官發(fā)育較快，心臟、血液循環(huán)、尾鰭原基和胸鰭原基在出膜前就已形成，從而使出膜后的仔魚能更好地適應貧營養(yǎng)型水體。出膜仔魚卵黃囊存在時間較長，降低了仔魚因攝取不到外源營養(yǎng)而死亡的風險。

綜上，寬口裂腹魚胚胎和早期仔魚發(fā)育特征與其棲息水域生態(tài)環(huán)境密切相關，這些特征是寬口裂腹魚對水域生態(tài)環(huán)境適應的一種表現。

4 結論

1)采用響應面法，最終得到水溫為16.0～17.0 ℃時，寬口裂腹魚人工催產使用的最佳催產藥物用量組合為PG 10.27 mg/kg、HCG 300.00 IU/kg和LHRH-A219.41 μg/kg。這表明，利用響應面法可以優(yōu)化寬口裂腹魚的催產方案并提高孵化率。

2)寬口裂腹魚受精卵卵徑為(2.50±0.24)mm，其卵黃含有豐富的營養(yǎng)物質，出膜480 h后仔魚卵黃囊才消耗完全，這有利于減輕寬口裂腹魚的攝食壓力，是生物個體在長期進化中形成的個體發(fā)育機制和生存策略。