一株豬鏈球菌2型的分離與鑒定

江 波 楊 蓉

（樂(lè)山市夾江縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川樂(lè)山 614100）

豬鏈球菌(Streptococcus Suis,SS)屬于乳酸桿菌目、鏈球菌科、乳球菌屬,是一種不運(yùn)動(dòng)、有莢膜、無(wú)鞭毛的革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌,該細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)條件要求較嚴(yán)格,在含血液或血清的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好,單個(gè)菌落直徑0.1～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊[1]。根據(jù)溶血情況不同,可分為α溶血、β溶血、γ溶血。α溶血致病力弱,菌落周圍形成草綠色溶血環(huán)；β溶血致病力強(qiáng),菌落周圍呈完全透明溶血環(huán)；γ溶血無(wú)致病性、無(wú)溶血現(xiàn)象。

按莢膜多糖(CPS)特異性差異,將SS分為35個(gè)血清型,即1/2型和1～34型[2]?，F(xiàn)在公認(rèn)的血清型中,1、2、7、9型都是豬的致病菌,其中2型豬鏈球菌致病力最強(qiáng),是一種重要的人畜共患病病原[3]。鏈球菌在全球分布廣泛,最早在荷蘭和英國(guó)被報(bào)道,在我國(guó)四川、廣西、上海等省份廣泛流行,給人體健康和公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了極大的威脅。該病主要導(dǎo)致豬出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥及化膿性淋巴結(jié)炎等[4],并且還能引起人類感染胸膜炎、腦膜炎、敗血癥等,甚至死亡[5,6]。此外,該病原常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductiveandrespiratory,PRRSV)、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type 2,PCV-2)等混合感染。2021年10月四川某豬場(chǎng)部分仔豬出現(xiàn)磨牙、轉(zhuǎn)圈、四肢劃水等神經(jīng)癥狀,關(guān)節(jié)腫脹、跛行、體溫普遍升高,發(fā)病豬部分出現(xiàn)死亡。對(duì)該豬場(chǎng)病豬進(jìn)行病料采集,細(xì)菌分離純化、革蘭氏染色、16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序、血清型確定和藥敏試驗(yàn)等確定致病菌的性狀,為豬場(chǎng)疾病的防治提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料采集

試驗(yàn)用病料采集于四川省某發(fā)病豬場(chǎng)病豬。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

健康小白鼠(約20 g/只)購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,試驗(yàn)前先置于室內(nèi)使小鼠適應(yīng)16～24 h。

1.3 主要試劑

藥敏紙片和染色試劑盒購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司,TIANamp Bacteria DNA KIT細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Tap PCR MasterMix、2 000 bp DNA Ladder購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司,麥?zhǔn)媳葷峁苜?gòu)于溫州康泰生物科技有限公司,引物購(gòu)于生工生物工程(上海)技術(shù)有限公司,瓊脂糖購(gòu)于美國(guó)海普生物公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

無(wú)菌采集病死豬心臟、腦、肺臟、肝臟等病變組織,劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿,放入培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)特性。挑取培養(yǎng)皿平板上不同形狀大小的菌落,分別進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和純化培養(yǎng)。

2.2 溶血試驗(yàn)

將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液劃線兔血平皿,放入培養(yǎng)箱37℃,培養(yǎng)24 h后,觀察溶血情況、菌落形態(tài)、挑取單個(gè)菌落進(jìn)行鏡檢。

2.3 細(xì)菌16S rRNA的PCR檢測(cè)

參考文獻(xiàn)中的引物序列[7],采用16S rRNA PCR通用引物(上游引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’,下游引物 R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGA CTT-3’) 對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)使用滅菌ddH20為模板做空白對(duì)照。PCR反應(yīng)體系20 μL：上下游引物各 1.5 μL,ddH2O 5 μL,Mix10 μL,DNA 模板2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃5 min；變性94℃45 s；退火溫度56℃45 s；延伸72℃50 s；35個(gè)循環(huán)；延伸72℃5 min；保溫15℃30 min。反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,對(duì)疑似目的條帶進(jìn)行測(cè)序。

2.4 細(xì)菌血清檢測(cè)

針對(duì)豬鏈球菌1型、2型、7型和9型莢膜多糖基因CPS所設(shè)計(jì)的特異性引物[8]Cps1I、Cps2J、Cps7H、Cps9H(引物序列見(jiàn)表1)對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系20μL：上下游引物各1.5 μL,ddH2O 5 μL,Mix10 μL,DNA模板 2 μL。PCR反應(yīng)體系為：預(yù)變性94℃5 min后進(jìn)入循環(huán),變性94℃30 s；各種引物的退火溫度見(jiàn)表2；延伸72℃30 s；30個(gè)循環(huán)后,延伸72℃5 min；保溫15℃30 min[9],反應(yīng)結(jié)束后,利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 引物序列

2.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將純化的細(xì)菌在37℃營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)18～24 h,用肉湯將試管中菌液稀釋至0.5(濃度1.5×108CFU/mL)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn),每個(gè)平皿貼5個(gè)藥敏紙片,紙片之間距離大于20 mm,紙片中心距平皿邊緣在10～15 mm之間,37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)抑菌圈直徑,判斷細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性[10],根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果比較敏感性。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)

將擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液與標(biāo)準(zhǔn)比濁管對(duì)比,將其稀釋至1.0(濃度3×108CFU/mL) 麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)。將小白鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組,每組5只。試驗(yàn)組,腹腔接種菌液,0.2 mL/只；對(duì)照組,腹腔接種培養(yǎng)基,0.2 mL/只；每天觀察記錄小鼠活動(dòng)狀況2次[11]。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離純化結(jié)果

病料直接涂抹于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,培養(yǎng)24 h后,觀察到直徑0.1～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的單個(gè)菌落。革蘭氏染色為陽(yáng)性,菌體單個(gè)或者2個(gè)卵圓形狀,短鏈狀,鏈較長(zhǎng)并長(zhǎng)短不一(見(jiàn)圖1-A)。

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖

3.2 溶血性結(jié)果

兔血瓊脂培養(yǎng)皿上有直徑為0.2～1.0 mm,形成灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊,存有針尖大小的菌落,具明顯的β溶血環(huán),見(jiàn)圖2。

圖2 血平板上溶血結(jié)果

3.3 細(xì)菌16S rRNA鑒定

鏈球菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂凝膠電泳圖譜如圖3,在第1泳道出現(xiàn)條帶,擴(kuò)增出的片段約1 600 bp,第2泳道為空白對(duì)照。用BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,該序列與豬球菌(Genbank登錄號(hào)：LC208642.1)同源性為99%,確定該株菌為豬鏈球菌。

圖3 16S rRNA PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3.4 血清型鑒定

針對(duì)豬鏈球菌1型、2型、7型和9型相對(duì)應(yīng)的Cps1I、Cps2J、Cps7H、Cps9H基因,進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳,結(jié)果如圖4,在1、3、4泳道未出現(xiàn)條帶,在2泳道上擴(kuò)增出的片段約250～450 bp,與Cps2J基因擴(kuò)增預(yù)期目的片段相符合,將目的條帶回收后測(cè)序。使用BLAST軟件將PCR測(cè)序結(jié)果在Genbank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,該序列與豬鏈球菌2型(登錄號(hào)：CP020863.1)同源性為99%,結(jié)果表明分離菌株為豬鏈球菌2型。

圖4 豬鏈球菌基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)NCCLS藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn),對(duì)所選藥物的敏感度分析結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,該菌株對(duì)氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢唑林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧沙星高度敏感,對(duì)卡拉霉素、克林霉素不敏感,對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明中度敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3.6 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

將該菌液接種小白鼠24 h后,小鼠出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、發(fā)抖、精神萎靡等神經(jīng)癥狀。并且,從接種小白鼠大腦、肝臟、肺臟等組織中分離出鏈球菌(見(jiàn)圖5)。

圖5 小白鼠典型病料染色圖片

4 討論

豬鏈球菌2型主要導(dǎo)致豬的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥及化膿性淋巴結(jié)炎等癥狀,此次試驗(yàn)涉及病豬主要表現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、磨牙、四肢呈劃水狀、盲目走動(dòng)等神經(jīng)癥狀,部分關(guān)節(jié)腫脹、走路成跛行、體溫普遍地升高(41～43℃),剖解后觀察肺部可見(jiàn)明顯出血點(diǎn),腹股溝淋巴結(jié)腫大,切開(kāi)腦頂部皮膚,皮下有大量淺黃色液體,顱下大面積出血,顱腔內(nèi)積液,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有黃色膠凍樣物,且癥狀與豬鏈球菌病基本相符。通過(guò)細(xì)菌分離純化、16S rRNA基因擴(kuò)增鑒定從該病豬體內(nèi)分離到一株豬鏈球菌,對(duì)該菌株進(jìn)行血清型PCR檢測(cè),確定為豬鏈球菌2型。分析其傳播途徑,主要傳染源為豬,經(jīng)呼吸道、消化道等途徑傳播,也可通過(guò)蒼蠅、老鼠攜帶傳播。據(jù)報(bào)道,該病在一年四季均可發(fā)生,西南地區(qū)在5—11月發(fā)病率最高[12]。近年來(lái),四川畜牧養(yǎng)殖業(yè)高速發(fā)展,豬鏈球菌疾病帶來(lái)的危害也逐漸凸顯,確定豬鏈球菌血清類型對(duì)該病的防治非常必要。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,鏈球菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌,理論上本次藥敏試驗(yàn)所選藥物對(duì)其均具有療效,但試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類和喹諾酮類藥物高度敏感,對(duì)氨基糖苷類和林可胺類藥物耐藥,對(duì)四環(huán)素類和磺胺類藥物中度敏感。分析原因：一方面,可能與各個(gè)地區(qū)用藥習(xí)慣不同有關(guān),另一方面,與臨床上不明病因的濫用抗生素有關(guān)[13]。

5 小結(jié)

豬鏈球菌是引起豬群發(fā)病的重要病原之一,也是影響生產(chǎn)效益的因素之一。豬場(chǎng)只有加強(qiáng)飼養(yǎng)管理,提高豬群免疫力,降低豬發(fā)病率,有效控制豬群疾病發(fā)生,提高養(yǎng)殖人員的積極性,才能提高豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益。此外,在西南地區(qū),每年5—11月是豬鏈球菌發(fā)病最高時(shí)期,著重加強(qiáng)對(duì)豬群進(jìn)行接種免疫、保健、消毒等措施以減少豬群的發(fā)病率。對(duì)豬鏈球菌病的防控,要注意多觀察、做到“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療”。