CD16+單核細胞變化與強直性脊柱炎的相關性研究

于 淼，楊 林，李偉靜，宋 宇，王玉輝，王 旭，鄭亮亮，宋玉國，

(1.北華大學醫(yī)學技術學院，吉林 吉林 132013；2.北華大學基礎醫(yī)學院，吉林 吉林 132013；3.北華大學附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

血液中的單核細胞(Monocyte)來源于髓系前體細胞，既是機體固有免疫的重要組成細胞，又是一類重要的抗原提呈細胞，在特異性免疫應答的誘導與調節(jié)中發(fā)揮著關鍵作用.有研究[1]發(fā)現(xiàn)：單核細胞是存在高度異質性的細胞群體，發(fā)揮不同作用的細胞其表面標志是不完全相同的.CD14分子是單核細胞表面重要的分化抗原，表達于成熟單核細胞表面；CD16分子是單核細胞表面Fc受體的一個亞類(FcγRⅢ).根據CD14和CD16表達強度的不同，可將單核細胞分為經典型單核細胞(CD14brightCD16-)、中間型單核細胞(CD14brightCD16+)和非經典型單核細胞(CD14dimCD16+)[1].本研究應用多參數(shù)流式細胞技術，建立了單核細胞亞型檢測方法，重點探討檢測CD16+單核細胞的臨床應用價值，并應用在常見的自身免疫病——強直性脊柱炎(Ankylosing spond- ylitis，AS)患者的診治中.AS是脊柱關節(jié)炎(Spondy- loarthritis，SpA)中常見的臨床疾病類型，AS的致病因素較多，自身免疫功能紊亂是介導AS發(fā)病的重要因素，外周血單核細胞亞型及其相關細胞因子參與其發(fā)病過程[2-3].其中，CD16+單核細胞(包括CD14brightCD16+和CD14dimCD16+單核細胞)在類風濕性關節(jié)炎(RA)[4-7]、人類炎癥性腸病(IBD)[8]、潰瘍性結腸炎(UC)[9]以及銀屑病性關節(jié)炎(PsA)[10]等許多自身免疫性疾病的進程中發(fā)揮了重要作用.單核細胞亞型檢測僅僅是對細胞表型進行檢測分析，其具體作用機制要通過表達細胞因子等方面進行功能分析.本研究應用流式細胞技術同步檢測了血漿相關細胞因子，并進行了初步相關性分析.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 研究對象

選擇2018年10月—2020年10月北華大學附屬醫(yī)院風濕免疫科強直性脊柱炎患者50例(AS組)，其中，男35例，女15例，男女比為7∶3；年齡21～74歲，平均(43.24±15.01)歲.AS診斷是基于修改后的紐約標準[11]，AS患者通過流式細胞分析儀(FCM)檢測HLA-B27[12]為陽性.健康對照組40例，來自北華大學附屬醫(yī)院健康檢查中心，其中，男26例，女14例，男女比13∶7，年齡21～79歲，平均(45.15±18.17)歲，經FCM檢測HLA-B27為陰性.AS組和對照組在年齡、性別和其他自然條件上具有可比性，招募患者的臨床特征在組間無任何基線差異.

1.1.2 主要儀器和試劑

流式細胞儀(NAVIOS型，貝克曼庫爾特公司，美國)；熒光標記的單克隆抗體CD14-PE、CD16-FITC和HLA-DR-PEcy5(貝克曼庫爾特公司，美國)；人血漿細胞因子TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN -γ檢測試劑盒(深圳唯公生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 標本采集

采用EDTA-K2抗凝真空采血管采集靜脈血2 mL.取抗凝全血100 μL用于流式細胞技術檢測單核細胞亞型；其余全血3 000 r/min離心10 min，分離上層血漿用于細胞因子檢測.

1.2.2 流式細胞術檢測外周血CD16+單核細胞及相關亞型

將10 μL CD14-PE和10 μL CD16-FITC標記的單克隆抗體加入流式細胞儀專用試管中，再加入100 μL抗凝全血，室溫避光標記15 min，再將紅細胞溶解，應用流式細胞儀進行檢測.以CD16-FITC為橫坐標、CD14-PE為縱坐標建立流式細胞儀檢測方案，檢測并記錄經典型單核細胞(CD14brightCD16-)、中間型單核細胞(CD14brightCD16+)和非經典型單核細胞(CD14dimCD16+)的百分率，重點分析后兩者CD16+單核細胞的變化情況.

1.2.3 流式細胞術定量檢測血漿相關細胞因子含量

定量校準品制備：準備8個1.5 mL離心管作為校準品梯度管，標記編號0～7；7號管留空，1號管中加入50 μL緩沖液，其他6管中加入150 μL緩沖液.向校準品瓶中加入0.5 mL緩沖液，充分溶解混勻并轉移至7號管，為最高濃度校準液；取50 μL 7號管中的校準品溶液至6號管中混勻，即為1∶4稀釋校準液，隨后依次從6～2號管中取50 μL校準品溶液至下一校準品梯度管，依次梯度稀釋得到5～1號管校準液；0號管中的緩沖液作為0濃度校準液.

細胞因子檢測：離心管中加入50 μL捕獲微球懸液(加入前充分混勻)、50 μL 樣本或校準液，充分混勻，避光室溫孵育1 h；磁性分離捕獲微球并棄去上清液，加入100 μL熒光標記抗體工作液，充分混勻，室溫避光孵育1 h；磁分離去上清，用200 μL磁珠稀釋液洗滌微球；再次磁分離去上清，用200 μL磁珠稀釋液重懸微球；最后應用流式細胞儀檢測各組血漿TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN-γ水平.

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 CD16+單核細胞及相關亞型檢測結果

采用流式細胞術檢測AS組(50例)、健康對照組(40例)患者外周血中3種亞型單核細胞的百分率.以SS INT為橫坐標、FS INT為縱坐標建立坐標圖，結果見圖1，圖中C門內的細胞為單核細胞；以CD16-FITC為橫坐標、CD14-PE為縱坐標建立坐標圖，結果見圖2.結果顯示：AS組CD16+單核細胞(CD14brightCD16+，CD14dimCD16+)百分率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經典型單核細胞(CD14brightCD16-)百分率低于對照組，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果見圖3.圖1和圖2中的粗點是用低概率方法處理后而顯示的散點圖，便于觀察.

圖1單核細胞群(C門)分析單核細胞亞型 Fig.1A monocyte population (phylum C) was selected for analysisN門.經典型單核細胞;O門.中間型單核細胞;P門.非經典型單核細胞.圖2流式細胞術檢測單核細胞亞型Fig.2Monocyte subtypes detected by flow cytometry

*.P<0.05，***.P<0.001.

2.2 檢測AS組和正常對照組血漿細胞因子水平

利用多參數(shù)流式細胞儀對兩組外周血細胞因子進行檢測，結果顯示：AS組外周血5種細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN-γ)水平均高于對照組(P<0.05)，且AS組TNF-α、IL-6、IFN-γ水平顯著高于對照組(P<0.01)，結果見圖4.IL-2、IL-4在兩組間無統(tǒng)計學差異，故結果未進行展示.

*.P<0.05，***.P<0.001.圖4AS組與對照組細胞因子Fig.4Cytokines in AS group and control group

2.3 AS組CD16+單核細胞百分率與3種細胞因子水平的相關性

Pearson相關檢驗結果顯示：AS患者外周血CD16+單核細胞(CD14brightCD16+和CD14dimCD16+)百分率與血漿細胞因子TNF-α、IL-6和IL-17A 的表達水平呈正相關關系，相關系數(shù)(r)分別為0.415 1、0.601 1和0.163 1 (P<0.01)，結果見圖5.

圖5細胞因子含量與CD16+單核細胞百分率的線性關系Fig.5Linear relationship between cytokine content and percentage of CD16+ monocytes

3 討 論

單核細胞作為一種重要的免疫細胞，在AS等自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用.單核細胞具有明顯的異質性，根據其表面標記CD14和CD16表達量不同可分為經典型單核細胞(CD14brightCD16-)、中間型單核細胞(CD14brightCD16+)和非經典型單核細胞(CD14dimCD16+)[1，13-14]，不同亞型單核細胞在表型、功能及炎癥激活作用上均有顯著的差異.有研究[15]表明：成熟巨噬細胞表達高水平的CD16，而表達低水平CD14，這個現(xiàn)象可使其與CD14bright單核細胞加以區(qū)分，進一步表明CD16+單核細胞比CD14bright單核細胞更成熟.

本研究應用流式細胞術檢測AS患者外周血單核細胞亞型的百分率，重點研究CD16+單核細胞的變化情況.結果發(fā)現(xiàn)：與健康對照組比較，AS患者CD16+單核細胞(CD14brightCD16+和CD14dimCD16+)的百分率明顯升高.經典的單核細胞池向CD16+單核細胞傾斜，分化的刺激因子主要是M-CSF[16-17]，進一步表明CD16+單核細胞在自身免疫性疾病中具有重要作用.

有研究[18]表明：CD16+單核細胞在多種自身免疫和感染性疾病的進展中發(fā)揮著重要作用，如風濕性關節(jié)炎、糖尿病、肺結核等.KAWANAKA N等[19]報道單核細胞亞群CD16表達升高是自身免疫性疾病和活躍性疾病狀態(tài)的特征.MELGERT BN等[20]研究表明：子癇前期患者外周血中經典型單核細胞比例下降，CD16+單核細胞比例上升.對其他一些炎癥性疾病的研究[21]也證實了CD16+單核細胞在各種自身免疫性疾病過程中發(fā)揮重要作用，包括類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、川崎病、感染性休克、多發(fā)性硬化、Ⅰ型糖尿病等.因此，我們推測CD16+單核細胞百分率升高可能是自身免疫性疾病和感染性疾病的共同現(xiàn)象.

為探究AS患者CD16+單核細胞百分率上調的具體作用機制，本研究應用流式熒光技術同步對兩組血漿樣本中細胞因子含量進行了檢測.本研究結果顯示：與健康對照組比較，AS組患者血漿炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-17A和IFN -γ)的含量升高(P<0.05)，其中，以TNF-α、IL-6和IL-17A上調更為明顯(P<0.01).對所得結果進行Pearson相關性檢驗分析，結果顯示：AS患者外周血CD16+單核細胞百分率與血漿細胞因子TNF-α、IL-6和IL-17A 的表達水平呈正相關關系，相關系數(shù)(R)分別為0.415 1、0.601 1和0.163 1 (P<0.01).提示AS患者CD16+單核細胞百分率的上調可促進相關炎癥細胞因子的釋放，進一步加重了AS患者的炎癥反應.

綜上所述，本研究表明：CD16+單核細胞百分率在AS患者中顯著上調，且與AS患者異常的部分細胞因子的表達呈正相關關系，表明CD16+單核細胞可能通過調節(jié)細胞因子的表達參與疾病的發(fā)生和發(fā)展，此結果為AS提供了一個免疫學發(fā)病機制的新觀點，未來針對AS患者CD16+單核細胞的檢測可能成為其疾病診斷的新指標.然而，本研究尚未闡明CD16+單核細胞調控相關細胞因子表達的具體機制，未來將通過動物模型和體外實驗進一步闡明其具體機制，為其在臨床疾病監(jiān)測中的應用提供更加科學的依據.