病理形態(tài)學與乳腺癌HER2過表達/擴增的關(guān)系

熊怡凡，王曉燕，黃蓉飛，龍小藝，張君莉，蔣安科

(成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 610500)

近年來，乳腺癌發(fā)病呈現(xiàn)逐年增長及年輕化趨勢，其病因尚未完全明確，目前認為，遺傳、飲食、激素及外界理化因素均與其發(fā)病有關(guān)[1].隨著分子生物學、腫瘤免疫學的發(fā)展，惡性腫瘤的相關(guān)研究已步入分子水平階段，故在諸多病因中，激素受體及基因的表達逐漸受到關(guān)注.乳腺上皮細胞在致癌因子作用下出現(xiàn)基因突變，發(fā)生無序的惡性增殖，并隨淋巴及血液循環(huán)在全身播散，形成遠處轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后[2].既往研究[3]發(fā)現(xiàn)：在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中存在諸多細胞因子參與，這些細胞因子可在一定程度上反映腫瘤的發(fā)展程度及預(yù)后情況.人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)為乳腺癌重要的原癌基因，HER2蛋白參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，如今針對HER2基因與蛋白的相關(guān)研究已成為熱點[4].本研究旨在探討乳腺癌病理形態(tài)學與HER2基因擴增及蛋白過表達的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材 料

納入2018年6月—2021年6月成都醫(yī)學院臨床醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院90例手術(shù)切除的乳腺癌組織標本，獲取的乳腺癌組織標本在離體1 h內(nèi)采用10%福爾馬林固定、石蠟包埋.

納入標準：患者為女性；初發(fā)病例；病理確診為乳腺癌.

排除標準：患者術(shù)前曾接受放療、新輔助化療等其他治療；患者病例資料不完整.

1.2 方 法

1.2.1 HER2基因擴增檢測

采用熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)進行HER2基因擴增檢測.將石蠟包埋的乳腺癌組織連續(xù)切片，獲得4 μm切片，置于載玻片上，65 ℃烘烤過夜；組織切片采用二甲苯脫蠟處理，分別浸于無水乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各2 min，去離子水浸泡3 min，吸除多余水分；切片采用30%酸性硫酸鈉處理30 min；2倍檸檬酸鈉緩沖液中漂洗2次，5 min/次；0.4 mL蛋白酶K儲存液(20 mg/mL)用檸檬酸鈉緩沖液稀釋，獲取蛋白酶K工作液，將組織切片浸泡其中，37 ℃孵育30 min，再用2倍檸檬酸鈉緩沖液中漂洗2次，5 min/次；組織切片置于0.1 mmol/L鹽酸中浸泡10 min，再用2倍檸檬酸鈉緩沖液中漂洗2次，5 min/次；組織切片用-20 ℃預(yù)冷的梯度酒精脫水后用丙酮浸泡2 min，自然干燥后加熱至56 ℃；在73 ℃的70%甲酰胺變性液中浸泡5 min，采用預(yù)冷的梯度酒精脫水，自然干燥后預(yù)熱5 min，于組織標本雜交區(qū)域加入10 μL探針復(fù)合物，上蓋封邊，置于濕盒中42 ℃過夜雜交；分別置于50%甲酰胺、2倍檸檬酸鈉緩沖液、0.1% NP-40液、70%乙醇中，自然干燥后加入10 μL DAPI顯色液，封片，熒光鏡下觀察.結(jié)果判讀：紅色信號計數(shù)/綠色信號計數(shù)>2.2為HER2基因擴增，<1.8為不擴增，18～2.2為不確定[5].

1.2.2 HER2蛋白、雌激素受體、孕激素受體表達檢測

采用免疫組織化學法(immunohistochemistry，IHC)進行HER2蛋白、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達檢測.將石蠟包埋切片的乳腺癌組織恒溫(68 ℃)烘烤30 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3%過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗3次，5 min/次；置于枸櫞酸抗原修復(fù)液，高壓鍋加熱，沸騰15 min，冷卻至室溫，蒸餾水漂洗2次，PBS沖洗3次，5 min/次；37 ℃下羊血清工作液中封閉30 min，倒除多余液體；加入50 μL一抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，5 min/次；倒除PBS，滴加50 μL生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；倒除PBS，加入50 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，5 min/次；倒除PBS，滴加50 μL新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺溶液，顯微鏡下觀察染色3 min，沖洗；蘇木精復(fù)染，沖洗，0.1%鹽酸酒精分化，沖洗，PBS返藍；梯度酒精脫水，干燥封片，光鏡下觀察.結(jié)果判讀：HER2表達-：10%以內(nèi)腫瘤組織細胞膜呈弱棕黃色，或無棕黃染色；+：10%以上腫瘤部分細胞膜呈弱棕黃色；++：10%以上細胞膜呈現(xiàn)完整的弱至中等強度棕黃色；+++：30%以上細胞膜全層高強度棕黃色，以+++為陽性結(jié)果.ER、PR表達-：陽性細胞率5%以內(nèi)；+：陽性細胞率5%～25%；++：陽性細胞率25%～50%；+++：陽性細胞率超過50%[6].

1.3 觀察指標

乳腺癌組織樣本中HER2基因擴增及HER2蛋白表達情況；采用Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析FISH、IHC兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性，并分析HER2基因擴增/蛋白過表達與患者病理形態(tài)學特征的關(guān)系.

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織樣本HER2基因擴增情況

90例乳腺癌組織標本中，F(xiàn)ISH檢出HER2基因擴增32例，陽性率為35.56%.見表1.

表1 乳腺癌組織樣本HER2基因擴增情況Tab.1 HER2 gene amplification in breast cancer tissue samples (n=90)

2.2 乳腺癌組織樣本HER2蛋白表達情況

90例乳腺癌組織標本中，IHC檢出HER2蛋白過表達24例，陽性率為26.67%.見表2.

表2 乳腺癌組織樣本HER2基因擴增情況Tab.2 HER2 gene amplification in breast cancer tissue samples (n=90)

2.3 FISH、IHC檢測結(jié)果相關(guān)性分析

Spearman分析顯示：FISH、IHC檢測結(jié)果存在相關(guān)性(P<0.05).見表3.

表3 FISH、IHC檢測結(jié)果相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis of FISH and IHC test results

2.4 HER2基因擴增/蛋白過表達與患者病理形態(tài)學特征的關(guān)系

HER2基因擴增、蛋白過表達陽性率在不同年齡階段、月經(jīng)狀況、病理類型、TNM分期患者中差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在不同組織學分級、腫瘤大小、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、雌激素受體(ER)表達情況、孕激素受體(PR)表達情況的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).見表4.

3 討 論

乳腺癌的預(yù)后主要取決于早期診斷及有效的治療方案，尤其對于早期患者而言，除了腫瘤分級等信息之外，明確其個體生物學信息對于治療方案的選擇具有重要意義[7].

HER2是在諸多惡性腫瘤中導(dǎo)致癌變頻率較高的原癌基因.HER2原癌基因位于17q21染色體，是一種有酪氨酸激酶活性的生長因子受體，在正常狀況下具有調(diào)節(jié)組織生長的作用，但當其基因結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變時，可能影響細胞分裂進程[8].HER2可抑制腫瘤細胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達而促進血管新生，進而促進腫瘤生長，還可使腫瘤細胞具有更強的侵襲性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)展[9].既往[10-11]報道顯示：乳腺癌患者中約有30%存在HER2基因擴增及蛋白過表達，這些患者平均生存期相對較短，且對三苯氧胺等常規(guī)治療藥物也表現(xiàn)出明顯的耐藥性，預(yù)后更差，但其對紫杉類、蒽環(huán)類藥物及曲妥珠單抗聯(lián)合化療反應(yīng)較好.FISH為檢測HER2基因擴增的金標準，IHC為檢測HER2蛋白表達的最常用手段.本研究顯示：90例乳腺癌組織標本中，F(xiàn)ISH檢出HER2基因擴增32例，陽性率為35.56%；IHC檢出HER2蛋白過表達24例，陽性率為26.67%，與既往報道[12]相符.Spearman分析顯示，F(xiàn)ISH、IHC檢測結(jié)果存在相關(guān)性，故而可將HER2基因擴增或HER2蛋白表達+++作為HER2陽性標志，以此指導(dǎo)臨床治療，對于HER2蛋白表達+、++者建議行FISH檢測.

據(jù)相關(guān)[13]報道，乳腺癌的年輕患者預(yù)后不理想，但HER2基因擴增/蛋白過表達與年齡的關(guān)系在諸多報道中結(jié)論不一.宋天豹等[14]針對原發(fā)性乳腺癌的報道顯示，HER2過表達與患者年齡呈負相關(guān)關(guān)系，且可作為HER2基因擴增/過表達的獨立相關(guān)因素.但本研究結(jié)果顯示：HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率在不同年齡階段中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示HER2基因擴增/蛋白過表達與患者年齡無關(guān)，分析結(jié)論差異可能受年齡分界、樣本量等諸多因素的影響.除此之外，HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率在絕經(jīng)前、絕經(jīng)后、非浸潤性、浸潤非特異性、浸潤特異性患者及TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者之間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明HER2基因擴增/蛋白過表達與患者月經(jīng)狀況、病理類型、臨床分期均無明顯相關(guān)性.組織學分級在一定程度上反應(yīng)腫瘤惡性程度，也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素.本研究結(jié)果顯示：HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率在不同組織學分級中差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即隨著乳腺癌組織學分級提高，HER2基因擴增/蛋白過表達陽性率隨之增加，這一結(jié)果與既往研究[15]一致，提示HER2基因擴增/蛋白過表達者腫瘤分化差，預(yù)后不佳.本研究顯示：HER2基因擴增/蛋白過表達率在不同腫瘤大小之間存在顯著差異，腫瘤直徑>5 cm者更易出現(xiàn)HER2基因擴增/蛋白過表達，腫瘤直徑<2 cm的則陽性率最低.腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌風險評級的重要參考因素，本研究結(jié)果顯示：乳腺癌伴隨腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HER2基因擴增及蛋白過表達更高，原因可能為HER2基因表達產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)細胞增殖分化的作用，HER2表達陽性者腫瘤細胞之間黏附作用相對更弱，故更容易出現(xiàn)擴散或轉(zhuǎn)移.乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與性激素的作用密切相關(guān)，而ER、PR作為激素受體在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16].既往研究[17]證實：ER、PR表達對乳腺癌治療方案的選擇及預(yù)后預(yù)測具有重要的指導(dǎo)價值.本研究顯示：ER/PR陰性患者HER2基因擴增及蛋白過表達率更高，與既往研究[18]一致，其原因為ER/PR陰性者腫瘤細胞增殖不受激素調(diào)控影響，組織分化較差，HER2基因更易出現(xiàn)免疫擴增，繼而導(dǎo)致HER2蛋白高表達，而ER/PR陽性者惡性程度一般更低，且對內(nèi)分泌治療更為敏感.

綜上所述，乳腺癌組織學分級、腫瘤直徑、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER/PR受體表達均與HER2基因擴增/蛋白過表達有關(guān)，了解HER2表達狀況對于乳腺癌的準確診斷及治療方案的選擇具有指導(dǎo)意義.