缺血性腦卒中患者miR-146a表達及對鈣調(diào)蛋白的影響

杜 麗，耿德勤

(1.徐州醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學附屬沭陽醫(yī)院，江蘇 沭陽 223600；3.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000)

腦卒中是全球中老年人群的第二大死亡原因，腦血管缺血是最常見的原因，約80%的腦卒中為缺血性腦卒中[1].腦卒中主要由大腦中動脈阻塞引起，同時鈣在細胞內(nèi)積累、活性氧生成等多種細胞和分子機制參與缺氧誘導的細胞損傷[2].近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)：腦缺血時不同miRNA表達改變會引發(fā)缺血后的神經(jīng)損傷或神經(jīng)保護作用.miR-146a已被認為是腫瘤細胞增殖、分化、遷移的主要調(diào)控因子之一[4]，動物模型也中發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠抑制微神經(jīng)侵入和氧化應(yīng)激損傷來保護腦缺血組織的神經(jīng)元活性[5].但關(guān)于缺血性腦卒中患者中miR-146a表達變化及可能作用機制的研究仍十分少見.因此，本研究探討缺血性腦卒中患者miR-146a表達及對鈣調(diào)蛋白的影響.

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2月—2020年5月徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院收治的急性缺血性腦卒中患者110例為缺血性腦卒中組.其中，男64例，女46例；年齡54～76歲，平均(67.35±4.91)歲.另收集健康志愿者110例為對照組，其中，男61例，女49例；年齡52～75歲，平均(66.82±5.60)歲.性別、年齡在兩組患者間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性.患者均自愿參與本研究，且簽署知情同意書.

入選標準：缺血性腦卒中發(fā)病14 d內(nèi)；美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS)5～30分.

排除標準：近1個月內(nèi)有腦出血病史；有造影劑過敏史；急性出血體質(zhì)，INR值>1.7或血小板計數(shù)<100×109/L.

1.2 材料與主要試劑

PC12細胞(上海通派生物有限公司)；胎牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)基(上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司)；Trizol RNA提取試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(廣州泛思生物科技有限公司)；脂質(zhì)體2000(英杰生命技術(shù)有限公司，美國)；鼠抗人Bcl-2同源拮抗蛋白/致死蛋白(Bax)單克隆抗體、鼠抗人半胱天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)單克隆抗體、兔抗人B淋巴細胞瘤/白血病-2(Bcl-2)單克隆抗體、鼠抗人鈣調(diào)蛋白編碼基因2(CALM2)單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 時熒光定量PCR檢測血清miR-146a表達

采集缺血性腦卒中組患者和對照組受試者外周靜脈血5 mL，2 000 r/min離心10 min，收集血清1 mL，-20 ℃保存待測.使用Trizol RNA提取試劑盒收集血清總RNA，分光光度計檢測其OD260/OD280吸光度值；實時熒光定量PCR檢測血清標本中miR-146a濃度.以cel-miR-39為內(nèi)參，miR-146a上游引物5′-AAGCAATAACCGAGACTGTCGACCTC-3′，下游引物5′-TGGAGCCTATGGGACGTGACTTAGGT-3′；cel-miR-39上游引物5′-CGAAACAGCATAGGTC ACGTTCGG-3′，下游引物5′-TGGAGCCTGGGACGT GACCTAGAC-3′.PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性1 min，95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán).引物設(shè)計由重慶波爾生物科技有限公司設(shè)計合成，相對定量法測定miR-146a表達水平.

1.3.2 PC12細胞培養(yǎng)與分組

PC12細胞接種于12孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃濃度為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，通過觀察發(fā)現(xiàn)約有90%融合時使用脂質(zhì)體2000進行瞬時轉(zhuǎn)染.將轉(zhuǎn)染的細胞分為空白對照組(常規(guī)培養(yǎng)，不作任何處理)、mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染mimics-miR-146a質(zhì)粒)、mimics陰性對照組(轉(zhuǎn)染mimics陰性對照質(zhì)粒)、inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染inhibitor-miR-146a質(zhì)粒)、inhibitor陰性對照組(轉(zhuǎn)染inhibitor陰性對照質(zhì)粒).脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染6 h內(nèi)用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，之后更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞沉淀.

1.3.3 細胞增殖和凋亡能力檢測

將5組PC12細胞接種于96孔板中，密度為4 000個/孔，于37 ℃濃度為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后每孔加入CCK-8試劑30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用全自動定量酶標儀測定450 nm波長處每孔的吸光度值.采用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平，將5組細胞分別用預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌3次，于4 ℃濃度為70%的乙醇溶液中固定24 h.調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取100 μL細胞懸液，加入濃度為1 mg/mL的碘化丙啶染液1 mL，4 ℃染色30 min，上流式細胞儀檢測，之后按照說明書步驟在避光環(huán)境中分別加入5 μL的膜聯(lián)蛋白V、PI，室溫下培養(yǎng)30 min，應(yīng)用流式細胞儀區(qū)分凋亡細胞，計算細胞凋亡率.

1.3.4 miR-146a靶基因預(yù)測

查詢PicTar、Targetscan生物信息學數(shù)據(jù)庫，預(yù)測miR-146a與鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM2的靶向結(jié)合位點.

1.3.5 RT-PCR檢測凋亡因子及CALM2 mRNA表達

使用Trizol RNA提取試劑盒收集5組PC12細胞的總RNA，分光光度計檢測其含量，應(yīng)用RT-PCR檢測Bax、Caspase-9、Bcl-2、CALM2 mRNA表達水平，以GAPDH為內(nèi)參，Bax上游引物5′-CATCTT AGGAAACGCCAGTGTTA-3′，下游引物5′-TGCCC CTGAAGTGTAGGCTAGGT-3′；Caspase-9上游引物5′-AGAAAC ATAGCATACCGCACTCC-3′，下游引物5′-CTCATCCTCTTCCACATCCATAT A-3′；Bcl-2上游引物5′-ACCCACCATACGATTAGAGATA C-3′，下游引物5′-TG AACGAACGACCGCAGCCAG T-3′；CALM2上游引物5′-CTCTGCCGGTCTCGCGT AGGCTA-3′，下游引物5′-TCAGCCGCAGTTGCAGT AGGAAC-3′；GAPDH上游引物5′-TAATCATATGAC GTAGCAGCGGATTC-3′，下游引物5′-TACTGTGC GTTAGACGGCATAGCATA-3′.PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 變性20 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共45個循環(huán).引物設(shè)計由重慶波爾生物科技有限公司設(shè)計合成，相對定量法測定mRNA表達水平.

1.3.6 Western blot檢測凋亡因子和CALM2蛋白表達

RIPA裂解液提取5組PC12細胞的蛋白，BCA法測定蛋白濃度.取20 μg蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，冰上轉(zhuǎn)膜1 h，室溫下封閉2 h，加入1∶500稀釋的抗人Bax單克隆抗體、1∶800稀釋的鼠抗人Caspase-9單克隆抗體、1∶300稀釋的兔抗人Bcl-2單克隆抗體、1∶500稀釋的鼠抗人CALM2單克隆抗體、1∶1 000稀釋的鼠抗人GAPDH單克隆抗體，4 ℃過夜，滴加1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG；ECL顯影，使用Image J軟件讀取各條帶的灰度值.

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 缺血性腦卒中組與對照組患者血清miR-146a表達水平

缺血性腦卒中組患者血清miR-146a表達水平為0.27±0.09，明顯低于對照組受試者血清miR-146a表達水平1.39±0.26，差異具有統(tǒng)計學意義(t=18.552，P<0.001).

2.2 各組細胞增殖和凋亡水平

mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染組PC12細胞增殖能力明顯高于對照組和mimics陽性對照組，PC12細胞凋亡率明顯低于對照組和mimics陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染組PC12細胞增殖能力明顯低于對照組和inhibitor陰性對照組，PC12細胞凋亡率明顯高于對照組和mimics陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).PC12細胞增殖能力和凋亡率在mimics陰性對照組、inhibitor陰性對照組、空白對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05).見表1.

表1 各組細胞增殖和凋亡水平Tab.1 Cell proliferation and apoptosis levels in each group

2.3 各組促凋亡因子表達水平

mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染組Bax、Caspase-9 的mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，Bcl-2 的mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染組Bax、Caspase-9的mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，Bcl-2 的mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).Bax、Caspase-9、Bcl-2 的mRNA和蛋白表達水平在mimics陰性對照組、inhibitor陰性對照組、空白對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05).見表2.

表2 各組促凋亡因子的mRNA和蛋白表達水平Tab.2 mRNA and protein expression levels of pro-apoptotic factors in each group

2.4 靶基因預(yù)測情況分析

使用PicTar、Targetscan生物信息學數(shù)據(jù)庫綜合預(yù)測miR-146a的靶基因，結(jié)果顯示miR-146a與鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM2存在靶向結(jié)合位點.

2.5 各組細胞中的CALM2的mRNA和蛋白表達水平

mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染組CALM2 的mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染組CALM2的 mRNA和蛋白表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05).CALM2的 mRNA和蛋白表達水平在mimics陰性對照組、inhibitor陰性對照組、空白對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05).見表3.

表3 各組細胞中CALM2的mRNA和蛋白表達水平Tab.3 CALM2 mRNA and protein expression levels in cells of each group

1.空白對照組；2.mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染組；3.mimics陰性對照組；4.inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染組；5.mimics陰性對照組.圖1Western blot檢測各組細胞中CALM2蛋白表達情況Fig.1Expression of CALM2 protein in cells of each group detected by Western blot

3 討 論

miRNA調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等過程，研究[6]發(fā)現(xiàn)：哺乳動物的大腦組織中存在miRNA高表達；miRNA參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和病理生理過程，與內(nèi)皮功能障礙、動脈斑塊不穩(wěn)定、腦水腫等腦卒中中間環(huán)節(jié)的發(fā)生密切相關(guān)[7].條件敲除Dicer的研究[8]證實了miRNA參與調(diào)控突觸形成、細胞增殖和分化、血管形成，進而影響大腦發(fā)育.部分參與調(diào)節(jié)腦發(fā)育的miRNA在腦缺血后被激活，提示腦發(fā)育與腦損傷之間存在重疊現(xiàn)象[9].識別與腦卒中發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNA，探明其生理作用和調(diào)控機制，并將其整合到基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是目前研究熱點之一.從RNA干擾這個表觀遺傳學方面探討腦卒中后腦損傷，對探尋急性缺血性腦卒中患者腦保護治療的靶點、改善治療預(yù)后具有重要意義.

近年來研究[10]發(fā)現(xiàn)：miR-146a能夠上調(diào)跨膜受體蛋白1和人類Jagged1基因表達，促進神經(jīng)元的生長和分化，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育.提示miR-146a可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關(guān)，但對缺血性腦卒中發(fā)生與發(fā)展的影響及相關(guān)機制仍未明確.本研究結(jié)果顯示：缺血性腦卒中組患者血清miR-146a表達水平明顯低于對照組健康志愿者，推測miR-146a可能參與介導缺血性腦卒中的發(fā)生與發(fā)展.進一步選用具有神經(jīng)細胞特性的PC12細胞深入探討miR-146a表達對缺血性腦卒中的影響[11]，結(jié)果顯示：mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染后PC12細胞的增殖能力明顯提升，凋亡率明顯下降；inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染后PC12細胞增殖能力明顯下降，凋亡率明顯提升.提示miR-146a表達下調(diào)能夠抑制PC12細胞增殖，加速細胞凋亡，導致缺血性腦卒中病情惡化.在mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染后PC12細胞中Bax、Caspase-9表達水平明顯降低，Bcl-2表達水平明顯升高；inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染后PC12細胞中Bax、Caspase-9表達水平明顯升高，Bcl-2表達水平明顯降低.Bax、Caspase-9是促凋亡因子，Bcl-2是抗凋亡因子，miR-146a表達下調(diào)能夠通過上調(diào)促凋亡因子表達，下調(diào)抗凋亡因子表達，促進PC12細胞凋亡，進一步加重缺血性腦卒中患者的病情.

研究[12]已證實：鈣超載參與腦缺血性損傷的發(fā)生，而鈣離子蛋白是鈣離子發(fā)揮生理功能的主要調(diào)控因子.動物實驗[13]顯示：腦缺血性再灌注后隨著神經(jīng)元細胞中鈣超載程度的增加，大鼠腦組織中CaM含量和活性明顯提升，缺血再灌注后的升高幅度明顯高于腦缺血后.本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)：急性缺血性腦卒中患者血清鈣調(diào)蛋白含量與神經(jīng)功能損傷程度呈正相關(guān).本研究使用PicTar、Targetscan生物信息學數(shù)據(jù)庫綜合預(yù)測miR-146a的靶基因結(jié)果顯示：miR-146a與鈣調(diào)蛋白編碼基因CALM2存在靶向結(jié)合位點，可能存在潛在的調(diào)控關(guān)系.進一步分析顯示：mimics-miR-146a轉(zhuǎn)染組CALM2的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，inhibitor-miR-146a轉(zhuǎn)染組明顯降低.提示miR-146a對CALM2具有負向調(diào)控作用，可推測缺血性腦卒中患者腦細胞損害機制中存在miR-146a對鈣調(diào)蛋白的調(diào)控作用，下調(diào)miR-146a會導致對鈣調(diào)蛋白表達的抑制作用降低，造成腦組織中鈣調(diào)蛋白過表達，并參與缺血性腦卒中的鈣超載損害過程.