蓖麻赤霉素氧化酶基因的全基因組鑒定和表達分析

代夢媛，高 梅，李文昌

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟作物研究所，云南 昆明 650205)

蓖麻(RicinuscommunisL.)作為一種不可食用的油料作物，具有藥用、工業(yè)原料、生物能源價值[1]。由于對蓖麻油供應(yīng)的需求增加，現(xiàn)在迫切需要創(chuàng)造出能在農(nóng)業(yè)上獲得更高產(chǎn)量的改良品種。蓖麻矮化是育種提高產(chǎn)量的一個重要方向[2-3]。

赤霉素(Gibberellins，GAs)是高等植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)劑，在植物、細菌、真菌中發(fā)現(xiàn)的136種中赤霉素僅有GA1、GA3、GA4、GA7具有生物活性[4]，作用于調(diào)控植物生長發(fā)育的各個方面，包括種子萌發(fā)、莖伸長、葉展開以及花和種子發(fā)育[5]。

高等植物中，GA代謝途徑已被廣泛研究[6]。根據(jù)活性酶和作用位點分為3個階段：第一階段，葉綠體中，C20二萜類前體牻?；姿?GGDP)由古巴焦磷酸合成酶(CPS) 和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(KS)2種萜類合成酶轉(zhuǎn)化成內(nèi)根-貝殼杉烯(Ent-kaurene)；第二階段，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶(KO)和內(nèi)根-貝殼杉烯酸氧化酶(KAO)2種細胞色素P450單氧化酶(P450s)將內(nèi)根-貝殼杉烯轉(zhuǎn)化成C20碳骨架的GA12和GA53；第三階段，胞質(zhì)中，GA20氧化酶(GA20ox)和GA3氧化酶(GA3ox)2種2-酮戊二酸依賴的雙加氧酶(2-ODDs)將GA12和GA53催化生成活性GAs，而活性GAs或其前體又被第3種2-ODD GA2氧化酶(GA2ox)鈍化，根據(jù)作用基團不同分為C19-GA2ox和C20-GA2ox[7]。

GA20ox、GA3ox和GA2ox作為催化GA生物合成途徑后期反應(yīng)的3種酶，屬于2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶超家族，每個酶都由一個多基因家族編碼[8-9]。植物GA20ox和GA3ox功能缺失導(dǎo)致活性GA降低，進而產(chǎn)生矮化表型，水稻OsGA20ox1和OsGA20ox基因缺失導(dǎo)致株高降低[10]，擬南芥AtGA2ox7和AtGA2ox8過表達會降低活性GA水平，同時產(chǎn)生矮化表型，雙基因敲除突變體活性GA水平增加2～4倍，產(chǎn)生GA過剩的表型[11]。

蓖麻是分枝型作物，多數(shù)品種高大且冠幅寬，不利于密植進而限制產(chǎn)量增加[12]，2010年已完成蓖麻全基因組序列，為蓖麻基因功能研究提供了新機遇[13]。叢安琪等[14]克隆蓖麻RcGA20ox1基因，分析并推測該基因功能。但是參與蓖麻赤霉素合成的氧化酶基因未得到系統(tǒng)解析。

因此，本研究利用生物信息學(xué)分析方法對蓖麻GAox進行全基因組鑒定，并分析其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育、基因上游2 kb啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測，通過蓖麻表達數(shù)據(jù)庫以及外源赤霉素和多效唑處理2個蓖麻品種的頂端嫩莖轉(zhuǎn)錄組測序分析蓖麻GAox基因表達模式。以期發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控株高的功能基因，為進一步開展蓖麻RcGAox基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

試驗于2019年4—9月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院老院部試驗地進行，以高稈蓖麻品種滇蓖2號(DB2)和矮稈滇蓖5號(DB5)為試材，設(shè)定2個處理500 μmol/L赤霉素(GA)和500 μmol/L多效唑(PAC)及一個空白對照組(CK)，正常田間管理。在蓖麻生長至7～8片真葉時進行第一次葉面噴施藥劑處理，噴施劑量以葉滴藥為準，每次處理間隔7 d，共進行3次葉面噴施處理，在距首次處理30 d后，分別采集蓖麻植株頂端嫩莖，按品種-處理編號，即DB2-CK、DB2-GA、DB2-PAC 和DB5-CK、DB5-GA、DB5-PAC，每個樣品設(shè)定3個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后-80 ℃保存，總RNA提取純化、cDNA測序文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序由北京百邁克生物科技有限公司完成。

1.2 基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

根據(jù)Han等[15]公布的擬南芥、水稻、大豆GA20ox、GA3ox和GA2ox基因序列號從Phytozome v12.1(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)下載蛋白質(zhì)序列。葡萄蛋白序列依據(jù)Giacomelli等[8]公布的序列編號從Phytozome下載，小桐子蛋白序列依據(jù)高聰聰?shù)萚16]公布的序列編號從小桐子基因組數(shù)據(jù)庫(http：//www.kazusa.or.jp/jatropha/)下載。以擬南芥蛋白質(zhì)序列為基序在Phytozome中Blast蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫，設(shè)定E值小于10-3e，得到的序列在Pfam(http：//pfam.xfam.org/)上檢測結(jié)構(gòu)域，去除沒有2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy結(jié)構(gòu)域的序列，最終獲得蓖麻GA20ox、GA3ox和GA2ox基因及氨基酸序列。

將得到的蓖麻GA氧化酶氨基酸序列輸入到ExPasy 網(wǎng)站(http：//au.expasy.org/tool.html)，采用Compute pI/MW 工具分析，得到GA20ox、GA3ox和GA2ox蛋白的多種理化性質(zhì)，包括氨基酸長度、分子量、等電點、穩(wěn)定性、親水性。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育、結(jié)構(gòu)域分析

利用ClustalW對蓖麻、擬南芥、水稻、大豆、葡萄、小桐子的GA20ox、GA3ox和GA2ox蛋白序列進行多重序列比對，隨后用Mega 7.0 軟件及鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)，Bootstrap=1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。利用MEME在線軟件分析蓖麻GA氧化酶蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，設(shè)定最大基序數(shù)量為10，其他數(shù)值為默認參數(shù)。

1.4 啟動子順式作用元件分析

利用TBtools軟件從蓖麻全基因組數(shù)據(jù)中批量提取GA20ox、GA3ox和GA2ox基因上游2 000 bp啟動子序列，利用PlantCARE對基因啟動子順式作用元件進行預(yù)測分析。

1.5 基因表達分析

轉(zhuǎn)錄組基于邊合成邊測序(Sequencing by synthesis，SBS)技術(shù)，采用 Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺進行對 cDNA 文庫進行測序，原始數(shù)據(jù)(Raw data)經(jīng)過測序質(zhì)量控制得到 Clean data，利用HISAT2系統(tǒng)將測序數(shù)據(jù)與參考基因組數(shù)據(jù)[13]進行比對，然后利用 StringTie 軟件將比對上的Reads進行組裝和定量，采用 FPKM 作為衡量基因表達水平的指標，最后進行差異表達篩選，分別比較處理組(GA 或 PAC)與 對照組(CK)，當表達差異倍數(shù)超過1.5，P<0.01 時，認定為差異表達基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻赤霉素氧化酶基因鑒定與理化性質(zhì)分析

通過同源序列比對與Pfam分析獲得滿足條件的蓖麻赤霉素氧化合成酶基因序列30條，其中RcGA2ox有7條，RcGA3ox有4條，RcGA20ox有19條。在基因組描述中28166.m001069、28166.m001071、29801.m003236、29842.m003651屬于RcGA2ox，而本研究中通過系統(tǒng)進化分析，認為以上4條序列屬于RcGA20ox，另外基因組描述中29682.m000588、29848.m004709和29848.m004710屬于RcGA20ox，而本研究構(gòu)建的進化樹將29682.m000588、29848.m004709歸為RcGA3ox，29848.m004710歸為RcGA2ox。如表1所示，對這3類蓖麻赤霉素氧化酶基因序列分別進行編號：RcGA2ox1……RcGA2ox7，RcGA3ox1……RcGA3ox4，RcGA20ox1……RcGA20ox19。利用ExPASy預(yù)測GA氧化合成酶蛋白序列理化性質(zhì)，結(jié)果表明：30條序列的平均蛋白長度334 aa，平均分子質(zhì)量37.94 ku，RcGA3ox1序列最短240 aa，其他序列長度都大于300 aa，RcGA20ox2序列最長389 aa，對應(yīng)分子質(zhì)量26.12～44.31 ku。pI值預(yù)測蓖麻赤霉素氧化酶酸堿性，pI值大于7僅有2個RcGA2ox1(7.60)和RcGA3ox1(7.82)，預(yù)測為堿性蛋白，其余28個蛋白pI值均小于7，分布在5.06～6.90，預(yù)測為酸性蛋白。穩(wěn)定性預(yù)測：數(shù)值小于40是穩(wěn)定蛋白，數(shù)值大于40是不穩(wěn)定蛋白，所以蓖麻赤霉素氧化酶中15個為穩(wěn)定蛋白，15個為不穩(wěn)定蛋白。親疏水性預(yù)測：分值越高疏水性越強，分值越低親水性越強，介于-0.5和+0.5之間為兩性蛋白，除了RcGA20ox18和RcGA20ox19為親水性蛋白，其他28個蛋白為兩性蛋白。蓖麻赤霉素氧化酶基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子個數(shù)除了RcGA20ox15、RcGA20ox16、RcGA20ox17以及RcGA3ox的4個成員共7條序列含有1個內(nèi)含子，其余23條序列均含有2個內(nèi)含子，說明親緣關(guān)系越近的基因，基因結(jié)構(gòu)越相似。從基因組描述來看，30條序列皆是與赤霉素代謝功能相關(guān)的預(yù)測蛋白。

2.2 蓖麻赤霉素氧化酶基因系統(tǒng)進化分析

為了確定蓖麻與擬南芥、水稻、大豆、葡萄、小桐子赤霉素氧化酶家族基因的進化關(guān)系，構(gòu)建了基于蛋白質(zhì)序列的進化樹，如圖1所示，大多數(shù)GA氧化酶基因可以被分離為5個不同的亞群：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和C20 GA2ox，分別對應(yīng)蓖麻GA氧化酶序列數(shù)量3，4，6，13，4條。6種植物的GA氧化酶在各個亞群內(nèi)的同源性大于彼此間的相似性，說明GA氧化酶的擴增發(fā)生在該蛋白家族進化的早期。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和C20 GA2ox 這4個亞群中，各物種以成對同源基因出現(xiàn)的比例為：擬南芥50.00%、水稻82.35%、大豆83.33%、蓖麻35.29%、小桐子0、葡萄46.15%，表明GA氧化酶在物種特有的進化途徑中擴增，在物種分離后發(fā)生重復(fù)，蓖麻與同屬大戟科的小桐子重復(fù)發(fā)生率低，說明蓖麻和小桐子的GA氧化酶基因在進化過程中較為保守，而葡萄沒有經(jīng)歷最近的基因組復(fù)制，其基因組基因也最保守[17]。本研究中將RcGA20ox7～RcGA20ox19蓖麻的13個序列與OsGA20ox5～OsGA20ox8水稻的4個序列歸為Ⅳ亞群。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亞群是明確區(qū)分出的3個亞群，分別對應(yīng)GA2ox、GA3ox、GA20ox，3個亞群的GA氧化酶具有明顯的功能差異，GA3ox和GA20ox促進活性GA的生成，GA2ox抑制活性GA，進而調(diào)節(jié)植物中活性GA的水平。C20 GA2ox在系統(tǒng)發(fā)育樹中已經(jīng)從C19 GA2ox(Ⅰ亞群)中分離出來，相應(yīng)的C20 GA2ox羥基化C20-GA前體，而C19 GA2ox羥基化C19-GAs前體。

圖1 擬南芥(At)、水稻(Os)、大豆(Gm)、葡萄(Vv)、小桐子(Jc)和蓖麻(Rc)中GA2ox、GA3ox和GA20ox的系統(tǒng)進化樹Fig.1 An unrooted phylogenetic tree representing relationships of GA2ox，GA3ox and GA20ox in Arabidopsis (At)，rice(Os)，soybean(Gm)，grape(Vv)，Jatropha cucas (Jc)and Riciuns communis L.(Rc)

2.3 蓖麻赤霉素氧化酶蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME對蓖麻30條RcGAox基因序列進行分析，發(fā)現(xiàn)10個保守基序(Motif)，長度15～41個氨基酸，E值小于3.8e-50，其中Motif 1、Motif 2、Motif 4存在30條序列中，Motif 6在RcGA3ox2中缺失，均存在其余29條序列。RcGA3ox包含Motif 1～Motif 9共9個基序，RcGA3ox2缺失下游的Motif 6，RcGA3ox1缺失上游的Motif 3和Motif 8。所有RcGA2ox成員均缺少Motif 8，且保守性較高，C20 GA2ox亞群成員均含Motif 1～Motif 6共6個基序，Ⅰ亞群成員均含Motif 1～Motif 7、Motif 9共8個基序。RcGA20ox的2個亞群基序有差異，Ⅲ亞群成員包含Motif 1～Motif 8共8個基序，而RcGA20ox6例外；Ⅳ亞群成員含有一個特有基序Motif 10，均無基序Motif 8；RcGA20ox6及RcGA20ox18、RcGA20ox19的基序特征與Ⅰ亞群RcGA2ox相同，如圖2所示，該結(jié)果與蓖麻RcGAox基因序列構(gòu)建的進化樹一致。

圖2 蓖麻GA2ox、GA3ox和GA20ox蛋白基序擴增Fig.2 Schematic diagram of amino acid motifs of GA2ox，GA3ox and GA20ox proteins in Ricinus communis L.

Domain是保守結(jié)構(gòu)域，一條系列一般有1～2個Domain，而一個Domain可能有多個Motif。選取蓖麻RcGAox基因的7條代表序列，分析保守結(jié)構(gòu)域(Domain)與基序(Motif)的位置對應(yīng)關(guān)系，如圖3所示，DIOX-N結(jié)構(gòu)域是具有2-氧化戊二酸/Fe(Ⅱ)依賴的雙加氧酶活性蛋白質(zhì)的高度保守N端區(qū)域，包含Motif 3、Motif 8和Motif 10，其中Motif 3保守性最高，Motif 8中LPWKET保守基序作用于GA底物結(jié)合[18]，RcGA3ox1序列缺失DIOX-N結(jié)構(gòu)域；2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy結(jié)構(gòu)域包含Motif 1、Motif 2、Motif 5、Motif 9及Motif 7部分，其中Motif 1和Motif 2保守性最高。

圖3 部分蓖麻GAox蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domain of partial GAox protein in Ricinus communis L.

如圖4所示，蓖麻30條與擬南芥3條GA氧化酶的2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對結(jié)果，存在所有序列中的HXDXnH其保守殘基位于Motif 1和Motif 2，是催化鐵結(jié)合的三肽結(jié)構(gòu)，與Fe(Ⅱ)形成共價鍵；YXnRXS作用于結(jié)合2-氧化戊二酸(2-OG)[19]，其中Motif 5包含Y殘基，Motif 7包含R和S殘基，RcGA20ox8缺少Y和S殘基，RcGA20ox7缺少Y殘基。

圖4 蓖麻和擬南芥GA氧化酶2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence aligment of 2OG-Fe(Ⅱ)-Oxy domain of Ricinus communis L. and Aribidopsis GAox protein

2.4 蓖麻赤霉素氧化酶基因在不同組織中的表達

參考Brown等[20]發(fā)布的蓖麻胚乳、葉片、雄花和發(fā)育種子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得20個赤霉素氧化酶基因的在各個組織中的表達量，蓖麻RcGAox在胚乳、雄花、葉片中特異表達的基因分別有7，2，1個，其中RcGA2ox2、RcGA3ox3、RcGA3ox4、RcGA20ox5、RcGA20ox7、RcGA20ox9和RcGA20ox12等7個基因在胚乳中特異表達，可能參與胚乳發(fā)育，RcGA2ox1、RcGA20ox2在雄花中特異表達，RcGA2ox3、RcGA20ox19在雄花中高表達，4個基因可能參與雄花發(fā)育，RcGA2ox7在葉片中特異表達，RcGA3ox1在葉片中高表達，發(fā)育種子少量表達，2個基因可能參與葉片展開。RcGA2ox3、RcGA20ox1、RcGA20ox13、RcGA20ox14、RcGA20ox15、RcGA20ox18、RcGA20ox19在所有組織中均有表達，其中RcGA20ox18在所有組織的表達量都相對較高，可能是功能保守的赤霉素氧化酶基因(圖5)。

圖5 GAox基因在蓖麻不同組織中表達的FPKM值Fig.5 Expression FPKM values of GAox genes in different tissues of Ricinus communis L.

2.5 蓖麻赤霉素氧化酶基因啟動子分析

順式作用調(diào)控元件是重要的分子開關(guān)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控一個動態(tài)基因活動網(wǎng)絡(luò)，控制各種生物過程，包括非生物應(yīng)激反應(yīng)、激素反應(yīng)和發(fā)育過程[21]。為進一步探究基因功能，利用PlantCARE對30個蓖麻GA氧化酶基因上游2 000 bp啟動子元件進行預(yù)測，結(jié)果在基因上游區(qū)域包含光反應(yīng)、激素、應(yīng)激脅迫、分生組織、光周期信號、低溫誘導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件。其中光反應(yīng)相關(guān)的順式元件數(shù)量最多，且在預(yù)測區(qū)域均勻分布，RcGA20ox10僅有光反應(yīng)順式元件(圖6)，表2列出各類型元件在基因上游出現(xiàn)的數(shù)量，根據(jù)元件作用分為：與逆境脅迫相關(guān)的元件，包括脅迫、厭氧誘導(dǎo)、低溫誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)；組織器官生長相關(guān)元件，包括分生組織、胚乳；與激素相關(guān)的元件，包括赤霉素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、生長素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蓖麻赤霉素合成相關(guān)基因中并非所有基因上游2 000 bp都存在赤霉素相關(guān)元件，僅有18個基因含1～2個赤霉素相關(guān)元件。

圖6 蓖麻赤霉素氧化酶基因啟動子保守順式元件分布Fig.6 Conservation cis-elements location of Ricinus communis L. GAox genes promoter

表2 蓖麻赤霉素氧化酶基因啟動子順勢作用元件數(shù)量Tab.2 Number of cis-acting elements in GAox promoter

2.6 赤霉素和多效唑處理對蓖麻赤霉素合成相關(guān)基因表達量的影響

如圖7所示，與對照相比，GA處理后30 d DB2和DB5 這2個品種株高表型增高；PAC處理后30 d這2個品種株高表型降低。處理后30 d進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果共有5個基因在GA和PAC處理后均檢測到表達，如圖8所示，GA處理后，RcGA2ox7、RcGA20ox15和RcGA20ox18在2個品種中均上調(diào)，其中RcGA2ox7和RcGA20ox18顯著上調(diào)(P<0.05)，PAC處理后，2個品種中RcGA2ox7下調(diào)，RcGA20ox18上調(diào)；滇蓖2號中GA處理后RcGA20ox18上調(diào)表達水平低于PAC處理，而在滇蓖5號中，GA處理后RcGA20ox18上調(diào)表達水平顯著高于PAC處理(P<0.05)；滇蓖2號中GA和PAC處理后RcGA20ox15表達量無顯著差異，而滇蓖5號中GA處理后RcGA20ox15顯著上調(diào)(P<0.05)。GA處理后2個品種中均下調(diào)的基因是RcGA20ox1和RcGA20ox14，PAC處理后RcGA20ox1在2個品種中均上調(diào)，而RcGA20ox14在滇蓖2號中下調(diào)，在滇蓖5號中上調(diào)，相對于對照，這種變化并不顯著。綜上所述，2個品種中的RcGA2ox7和RcGA20ox1基因在GA和PAC的作用下都表現(xiàn)出相同表達模式，所以認為RcGA2ox7和RcGA20ox1在調(diào)控赤霉素合成過程中具有重要作用，RcGA20ox15和RcGA20ox18在外源GA及其抑制劑的作用下表現(xiàn)出的品種差異，矮稈品種DB5基因表達水平更顯著，RcGA20ox14對外源GA敏感而對PAC不敏感。

圖7 赤霉素和多效唑?qū)Ρ吐橹旮咦兓挠绊慒ig.7 Effects of gibberellin and paclobutrazol on plant height of Ricinus communis L.

不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。Different small letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

本研究將30個蓖麻GA氧化酶分為5個亞家族：Ⅰ(GA2ox)、Ⅱ(GA3ox)、Ⅲ(GA20ox)、Ⅳ(GA20ox)和C20 GA2ox，Huang等[22]在比較了苔蘚、綠藻及陸生植物的GAox基因后，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)和特征基序分析，將陸生植物的GAox分為8個亞群C19-GA2ox、C20-GA2ox、GA20ox、GA3ox、GAox-A、GAox-B、GAox-C和 GAox-D，其中GAox-A、GAox-B、GAox-C和 GAox-D對應(yīng)本研究中Ⅳ(GA20ox)亞群。本研究中系統(tǒng)發(fā)育分析表明，GA3ox和C19-GA2ox具有共同的起源，類似的Giacomelli等[8]利用2種比對方法結(jié)果都顯示GA3ox和C19-GA2ox有共同的起源，且GA3ox和C19-GA2ox都代謝C19-GA底物；然而在Han等[15]的研究中GA3ox和C20-GA2ox的親緣關(guān)系更近；Serrani等[23]研究認為，C19-GA2ox和C20-GA2ox蛋白來源于一個共同的GA2ox祖先的重復(fù)事件，與它們共同的2β-羥化酶活性一致。綜上所述，GA3ox、C19-GA2ox及C20-GA2ox之間的關(guān)系存在爭議，GAox基因的多樣性和功能分化有關(guān)，然而目前對各個類群基因功能探知還有待進一步的研究。

本研究中發(fā)現(xiàn)8個RcGAox基因在雄花中高表達，Tan等[24]和代夢媛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，GA與蓖麻性別決定相關(guān)，多效唑(100～500 mg/L)處理后，花序中雄花數(shù)量顯著增加，高GA 水平促進雌花發(fā)育，低GA 水平促進雄花發(fā)育，所以8個RcGAox基因調(diào)控GA水平可能與性別決定相關(guān)。另外，在擬南芥和牽?；ㄖ蠫A是從雄蕊到花瓣轉(zhuǎn)運[26]，推測雄花中合成的GA從雄花轉(zhuǎn)運到花序的其他器官，促進器官發(fā)育。本研究中發(fā)現(xiàn)，RcGA2ox7、RcGA3ox1和RcGA20ox13個GA調(diào)控基因在葉片中高表達，而煙草和擬南芥中證實了GA是從葉片到莖稈轉(zhuǎn)運[27]，葉片作為GA合成的主要器官，葉片合成的GA轉(zhuǎn)運到莖稈促進莖稈伸長。

啟動子區(qū)域順勢作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)蓖麻GAox包含與光反應(yīng)、光周期信號、植物激素、應(yīng)激脅迫、分生組織相關(guān)的順勢作用元件，結(jié)果與董鳳等[28]一致。蓖麻GAox雖然是赤霉素合成相關(guān)基因，但是在啟動子的順勢作用元件中有12個基因上游缺少赤霉素相關(guān)的順勢作用元件，可能是基因上游2 000 bp的啟動子序列過短未包含GA元件，或者是通過GA信號通路上的其他作用因子調(diào)控其響應(yīng)內(nèi)源GA含量變化。

蓖麻嫩莖轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果沒有覆蓋所有的GAox基因，有研究報道，GA生物合成基因在不同組織、細胞周期和發(fā)育階段差異表達[26]。GA3ox作為催化合成活性GA最后一步的關(guān)鍵酶，嫩莖轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果沒有覆蓋任何一個RcGA3ox。GA作為一種移動的信號分子，由葉片、花器官等部位合成后運輸?shù)角o端和根端作用于莖和根伸長[26]，嫩莖不一定合成活性GA。本研究中發(fā)現(xiàn)，RcGA3ox1缺失保守結(jié)構(gòu)域可能會影響基因功能，另外基因表達分析發(fā)現(xiàn)，RcGA3ox1在葉片中高表達，而RcGA3ox3和RcGA3ox4在胚乳中特異表達。擬南芥AtGA3ox具有獨特的器官特異性表達模式，其成員在發(fā)育過程中扮演不同角色[26]。所以，RcGA3ox基因可能存在功能調(diào)控上的差異。

在嫩莖中表達的5個RcGAox基因，其中RcGA2ox7鈍化活性GA，RcGA20ox1、RcGA20ox14、RcGA20ox15和RcGA20ox18調(diào)控活性GA生成。擬南芥中GA20ox突變導(dǎo)致植株出現(xiàn)半矮化表型[29]，水稻GA缺陷型半矮化突變體Sd1是由OsGA20ox2位點變異引起[30]。扁豆PcGA2ox1導(dǎo)入茄科植物、果樹和觀賞植物中，植株表現(xiàn)矮化，活性GA水平降低[31]。水稻GA2 氧化酶 GA2ox可以使 GA1和GA4 等活性 GA 發(fā)生 2β-羥化作用，降低活性GA水平，獲得顯著半矮化性狀[32]；從Williams香蕉和矮化突變體中發(fā)現(xiàn)6個GA合成基因MaGA20ox4、MaGA20ox5、MaGA20ox7、MaGA2ox7、MaGA2ox12和MaGA2ox14影響GA的含量[33]。本研究中外源GA處理，RcGA2ox7高表達，鈍化活性GA，降低體內(nèi)GA水平，同時RcGA20ox1和RcGA20ox14低表達，GA合成速率降低；外源多效唑處理后抑制GA合成，體內(nèi)GA水平降低，RcGA2ox7低表達，RcGA20ox1高表達，促進活性GA合成，負調(diào)控體內(nèi)活性GA保持穩(wěn)態(tài)，RcGA20ox14無顯著變化，推測RcGA2ox7、RcGA20ox1和RcGA20ox14可能是通過調(diào)控植物體內(nèi)活性GA的水平來響應(yīng)外源激素對株高的作用，是參與赤霉素合成途徑來調(diào)控蓖麻株高的主要基因。

本研究通過生物信息學(xué)方法和轉(zhuǎn)錄組測序表達譜分析對蓖麻赤霉素氧化酶基因進行系統(tǒng)的鑒定和表達分析，為初步解析其潛在功能提供依據(jù)。后續(xù)應(yīng)重點關(guān)注RcGAox基因克隆和功能分析等研究，進一步解析RcGAox基因在調(diào)控蓖麻株高方面的分子作用機制。