江蘇大豆上分離的豇豆輕斑駁病毒基因組序列克隆及特征分析

吉 穎，孫 楓，吳淑華，李 碩，涂麗琴，高丹娜，崔曉艷，陳 新，季英華，郭青云

(1.青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院，青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

豇豆輕斑駁病毒(Cowpeamildmottlevirus，CpMMV)是一種重要的植物RNA病毒，隸屬于乙型線狀病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)[1]，病毒粒子為彎曲絲狀顆粒，大小約為650 nm×15 nm，基因組為單鏈正義RNA，全長(zhǎng)8 194 bp，包含5′帽子和3′Poly(A)尾，共編碼6個(gè)蛋白：參與病毒基因組復(fù)制的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)，參與病毒運(yùn)動(dòng)的三重基因塊1(Triple gene block 1，TGB1)、三重基因塊2(Triple gene block 2，TGB2)和三重基因塊3(Triple gene block 3，TGB3)，外殼蛋白(Coatprotein，CP)，核酸結(jié)合蛋白(Nucleic acid binding protein，NBP)[2]。

CpMMV主要由煙粉虱以非持續(xù)方式傳播[3]，也能通過(guò)種子傳播[4]，危害大豆、豇豆、菜豆等多種豆科作物。CpMMV最早于1973年在加納首次報(bào)道[5]，隨后在非洲[6-10]、美洲[11-15]和亞洲[16-20]等多個(gè)熱帶和亞熱帶地區(qū)都出現(xiàn)該病危害。在我國(guó)，CpMMV最早于2013年在臺(tái)灣地區(qū)出現(xiàn)危害報(bào)道[19]，之后在海南[20]和安徽[21]也出現(xiàn)危害報(bào)道，呈逐漸蔓延和加重的趨勢(shì)。目前，雖然CpMMV發(fā)生危害的報(bào)道較多，但明確全基因組序列信息的分離物還較少，我國(guó)目前僅海南[20]和安徽[21]2個(gè)分離物有基因組信息報(bào)道。

2019年在對(duì)江蘇省大豆病毒病進(jìn)行調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)卮蠖股弦渤霈F(xiàn)了CpMMV的危害，為深入了解該分離物的特征及其分類地位，本研究利用分段法克隆其全基因組序列，解析基因組結(jié)構(gòu)特征，旨在明確分類地位，為后續(xù)進(jìn)一步研究CpMMV的進(jìn)化特征及致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)樣品

供試樣品為2019年采自徐州的大豆病樣，病樣葉片出現(xiàn)明顯黃化、花葉等癥狀。

1.2 總RNA提取

病樣總RNA的提取參照吳淑華等[22]的方法進(jìn)行。取采集的大豆葉片放入液氮中處理后，轉(zhuǎn)移至全自動(dòng)樣品研磨儀中研磨充分，加1 mL RNAiso Plus溶液，搖勻后靜置5 min；加400 μL RNA提取液，渦旋振蕩充分，室溫放置5 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心 10 min；取上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，加入等量的冰異丙醇，輕輕混勻，-20 ℃放置30 min；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，后棄上清，用1 000 μL 75% 酒精清洗沉淀 2 次后，4 ℃ 8 000 r/min，離心5 min，棄上清，待酒精揮發(fā)，加入30 μL的0.1% DEPC 水中，測(cè)定 RNA的濃度和質(zhì)量后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA合成

利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：Random 6 mers(10 μmol/L)1.0 μL，RNA 2.0 μL，ddH2O 5.0 μL，dNTP Mix(10 μmol/L)1.0 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)1.0 μL；65 ℃反應(yīng)5 min，取出反應(yīng)液加入ddH2O 5.0 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.5 μL，5 × PrimeScript Buffer 4.0 μL，PrimeScriptRTase(200 U/μL)0.5 μL，于30 ℃ 10 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min后結(jié)束，獲取的cDNA放于-20 ℃冰箱保存。

1.4 CpMMV基因組克隆

利用已公開(kāi)的CpMMV基因組序列，合成4對(duì)特異性引物(表1)，以上述的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：2 × PrimeSTARMax Premix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8 μL，總體積20 μL；PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃10 s，53 ℃ 15 s，72 ℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物與pEAZY-Blunt Zero載體連接，熱激法轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布均勻于氨芐(Amp+)培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)，PCR驗(yàn)證單克隆菌落，驗(yàn)證正確后將其送至通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測(cè)序。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.5 序列分析

測(cè)序完成后，依據(jù)片段的引物去掉兩端殘留的序列，拼接獲得基因組序列，將本研究的CpMMV基因組序列與已公布的CpMMV不同分離物及同屬其他病毒的基因組序列進(jìn)行分析，序列同源性分析、多重比對(duì)利用ClustalX、BioEdit等軟件及NCBI網(wǎng)站上的Blast完成，聚類分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件的鄰接法完成[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpMMV基因組克隆策略

鑒于CpMMV基因組序列全長(zhǎng)超過(guò)8 kb，因此擬采用分段克隆法：通過(guò)圖1中引物(4對(duì))，將CpMMV全長(zhǎng)分為4段進(jìn)行擴(kuò)增和克隆。相鄰片段之間保留重疊部分序列，以保證序列能準(zhǔn)確拼接。

圖1 CpMMV基因組克隆策略Fig.1 The cloning strategy for CpMMV

2.2 CpMMV基因組克隆

基于制定的分段法克隆基因組序列策略，針對(duì)CpMMV基因組全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物(表1)。以上述的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，4對(duì)引物都擴(kuò)到相對(duì)應(yīng)的特異性條帶(圖2)。將目的條帶進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pEAZY-Blunt Zero載體于25 ℃反應(yīng)40 min連接，熱激法轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞后經(jīng)單菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性克隆鑒定后送至公司進(jìn)行測(cè)序，最后經(jīng)序列拼接獲得CpMMV江蘇分離物的全基因組序列。

圖2 CpMMV基因組分段RT-PCR擴(kuò)增Fig.2 RT-PCR amplification of CpMMV genome

2.3 CpMMV江蘇大豆分離物基因組結(jié)構(gòu)特征

CpMMV基因組序列經(jīng)信息分析后，結(jié)果顯示，其基因組全長(zhǎng)為8 194 bp，共編碼6個(gè)蛋白(圖3)，其中73～5 652 bp編碼由1 859個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約為211.3 ku的復(fù)制酶蛋白(全長(zhǎng)5 580 bp)，5 681～6 376 bp編碼由231個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約為25.6 ku的TGB1蛋白(696 bp)，6 376～6 696 bp編碼由106個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約為11.6 ku的TGB2蛋白(321 bp)，6 674～6 880 bp編碼由68個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約為7.7 ku的TGB3蛋白(207 bp)，6 896～7 762 bp編碼由288個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約為32 ku的外殼蛋白(867 bp)，7 765～8 076 bp編碼由103個(gè)氨基酸組成分子質(zhì)量約為11.8 ku的NBP蛋白(312 bp)；同時(shí)序列分析結(jié)果顯示，CpMMV江蘇分離物基因組兩端各有一個(gè)非編碼區(qū)：5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為72 nt，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)度為117 nt(圖3)。

圖3 江蘇侵染大豆的CpMMV基因組結(jié)構(gòu)Fig.3 Genome organization of CpMMV infecting soybean in Jiangsu Province

對(duì)CpMMV江蘇分離物編碼蛋白與其他分離物之間的同源性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其與中國(guó)的2個(gè)分離物(MN908944、KY420906)同源性相對(duì)較高，而與其他分離物同源性相對(duì)較低；在6個(gè)編碼蛋白中，CP與其他分離物之間的同源性最高(96.5%～100.0%)，暗示了CP蛋白可能相對(duì)保守，TGB2(84.0%～99.1%)和NBP(87.4%～98.1%)次之，RdRp(81.1%～98.2%)、TGB1(81.0%～97.0%)和TGB3(80.9%～95.6%)同源性相對(duì)較低，暗示了其在不同分離物之間可能表現(xiàn)較好的多樣性(表2)。

表2 CpMMV江蘇分離物編碼蛋白與其他分離物之間的同源性Tab.2 Amino acid sequence identities of CpMMV-Jiangsu with other CpMMV isolates %

2.4 CpMMV江蘇大豆分離物聚類分析

對(duì)獲得的CpMMV江蘇大豆分離物基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與我國(guó)之前報(bào)道的分離物同源性相對(duì)較高：與安徽分離物(MN908944)的同源性最高(98.2%)，與海南分離物(KY420906)同源性次之(96.0%)，而與其他國(guó)外分離物之間的同源性相對(duì)較低(低于82.7%)(表3)；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果也顯示，其他CpMMV分離物和本研究的CpMMV分離物都聚類到一個(gè)大分支上，其中安徽分離物、海南分離物共同聚類在一個(gè)小分支上，相對(duì)近緣，而與美國(guó)、巴西、印度、墨西哥、肯尼亞等其他國(guó)外分離物聚類到不同的分支，相對(duì)遠(yuǎn)緣(圖4)。

表3 序列分析涉及CpMMV與其他相關(guān)香石竹潛隱病毒屬成員的序列信息Tab.3 Sequence information of CpMMV and other member of Carlavirus used in the phylogenetic analysis

■.本試驗(yàn)測(cè)定的CpMMV分離物。■.Isolate of CpMMV sequenced in this study.

3 討論

豇豆輕斑駁病毒是我國(guó)近年來(lái)新發(fā)生的一種植物病毒，主要侵染豆科等多種作物，導(dǎo)致作物出現(xiàn)葉片輕斑駁褪綠等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生畸形、甚至壞死癥狀[24]，造成豆科等作物減產(chǎn)10%～15%，而其他病毒與CpMMV共侵染會(huì)帶來(lái)更嚴(yán)重的危害損失[1，11]。因此，應(yīng)加強(qiáng)CpMMV在生產(chǎn)上的監(jiān)測(cè)，預(yù)防其對(duì)我國(guó)作物安全生產(chǎn)造成進(jìn)一步危害。

雖然世界各地已有多個(gè)CpMMV基因組相關(guān)報(bào)道[2，13]，但目前在我國(guó)僅有海南[20]和安徽[21]2個(gè)分離物有基因組報(bào)道。本研究采用分段法克隆并獲得了江蘇CpMMV大豆分離物的基因組序列，明確了其基因組結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，其與我國(guó)其他2個(gè)分離物相對(duì)近緣，其中與安徽分離物同源性最高，這是江蘇省第1個(gè)CpMMV基因組序列相關(guān)報(bào)道。這些結(jié)果將有助于豐富CpMMV分子變異和群體遺傳學(xué)研究，為后續(xù)深入解析該病毒的流行及演化規(guī)律提供支持，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步研究其成災(zāi)病理和有針對(duì)性地制定防控策略也有重要意義。

CpMMV雖然早在1973年就有發(fā)生危害報(bào)道[5]，但在我國(guó)，直到2009年(臺(tái)灣地區(qū)：菜豆、豇豆)才首次出現(xiàn)危害[19]，隨后該病在江西(2013—2014年，四季豆)、海南(2016年，豇豆)[20]、安徽(2019年，大豆)[21]相繼出現(xiàn)危害，從該病毒在我國(guó)的發(fā)生危害時(shí)間，結(jié)合部分地區(qū)基因組分析結(jié)果(目前，我國(guó)有基因組報(bào)道僅有海南分離物和安徽分離物)，可以推測(cè)我國(guó)發(fā)生的CpMMV極有可能是從國(guó)外傳入，最早在臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生，之后擴(kuò)散到江西、海南，近年來(lái)陸續(xù)向北擴(kuò)散到安徽、江蘇等地。鑒于CpMMV是一種重要的粉虱傳病毒，在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都有發(fā)生危害報(bào)道，同時(shí)CpMMV在豇豆、大豆、花生等[5]多種作物上有種子攜帶病毒報(bào)道，存在種傳風(fēng)險(xiǎn)[4]，因此，隨著傳播介體的大發(fā)生、各地種苗調(diào)運(yùn)的頻繁以及耕作模式的更迭，此類病毒的不斷擴(kuò)展蔓延將會(huì)對(duì)豆類等作物的安全生產(chǎn)帶來(lái)新的威脅，而目前對(duì)該病毒的成災(zāi)機(jī)理、品種抗性、防控技術(shù)等研究還較少，因此，生產(chǎn)上要密切關(guān)注此類病害的發(fā)生動(dòng)態(tài)，加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)地種苗的檢測(cè)，做好應(yīng)急防控技術(shù)研究和儲(chǔ)備，及早發(fā)現(xiàn)，盡早防控，減少損失。