桃葉衛(wèi)矛莖段愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽再生體系的建立

李瑞靜，田 菊,2，劉 洋,2

（1內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限公司，呼和浩特 011517；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010019）

0 引言

園林綠化建設(shè)既是城市經(jīng)濟(jì)全面快速發(fā)展的重要推動力量，也是保護(hù)城市生態(tài)環(huán)境、提升和優(yōu)化人們的審美品味的重要基礎(chǔ)[1]，實(shí)踐證明，城市園林綠化的過程中，觀果樹種具有非常重要的價值和作用。在園林綠化建設(shè)過程中，需充分全面地發(fā)揮觀果樹種的價值，更好地提升城市園林綠化的建設(shè)成效，保護(hù)城市生態(tài)環(huán)境[2]。桃葉衛(wèi)矛(Euonymus maackii)又名絲棉木、白杜、明開夜合，衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬落葉小喬木[3]，是園林綠化中不可多得的優(yōu)良材料，除了具有抗逆性能力強(qiáng)、養(yǎng)護(hù)成本低、取材方便等特點(diǎn)，還兼具彩色、適應(yīng)范圍廣、病蟲害少等優(yōu)點(diǎn)，是豐富園林綠化樹種的優(yōu)良種質(zhì)資源[4]。桃葉衛(wèi)矛無性繁殖技術(shù)研究是加大桃葉衛(wèi)矛優(yōu)株在園林綠化中應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，桃葉衛(wèi)矛無性繁殖方法主要有嫁接、扦插等。上述無性繁殖方法對繁殖材料需求量大，不適用于材料有限的優(yōu)良單株進(jìn)行大量繁殖，且嫁接繁殖成活率低、扦插繁殖系數(shù)小、周期長、受氣候條件影響大、生產(chǎn)成本高，不利于工廠化育苗生產(chǎn)。組培繁殖技術(shù)具有繁殖系數(shù)大，節(jié)約繁殖材料，能保持原有品種優(yōu)良性狀，不受自然環(huán)境和季節(jié)的影響，可進(jìn)行工廠化生產(chǎn)的優(yōu)勢。開展桃葉衛(wèi)矛的組培繁殖技術(shù)研究，對促進(jìn)桃葉衛(wèi)矛的良種選育、優(yōu)質(zhì)苗木規(guī)模化生產(chǎn)均具有非常重要的意義。

關(guān)于桃葉衛(wèi)矛組培繁殖技術(shù)研究，李春玲等[5]以桃葉衛(wèi)矛的嫩莖為材料，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽建立桃葉衛(wèi)矛再生體系，但并未開展桃葉衛(wèi)矛的組培繼代繁殖系數(shù)研究。李曉青等[6]以桃葉衛(wèi)矛當(dāng)年生嫩莖為外植體，誘導(dǎo)產(chǎn)生腋芽建立桃葉衛(wèi)矛再生體系，其腋芽成芽率最高可達(dá)50%，繼代增殖系數(shù)最高為3.3，平均生根數(shù)最多為2.7。吳建華等[7]以桃葉衛(wèi)矛幼嫩葉片為材料，建立桃葉衛(wèi)矛再生體系，其增殖系數(shù)為3.6。已知桃葉衛(wèi)矛繼代增殖系數(shù)平均水平為3.0左右，利用現(xiàn)有組培繁殖技術(shù)工廠化生產(chǎn)時，發(fā)現(xiàn)其繼代系數(shù)低，不能滿足規(guī)?；a(chǎn)。此外，研究表明，愈傷組織再生能力強(qiáng)，可用于研究植物生長發(fā)育及分化機(jī)制、遺傳變異規(guī)律等，因此，愈傷分化體系研究對桃葉衛(wèi)矛品種改良具有重要意義。同時，大多數(shù)能進(jìn)行組培繁殖的林木，都能以腋芽萌發(fā)途徑建立組培繁殖體系，但以腋芽萌發(fā)為主要途徑的組培增殖率通常低于愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽的增殖率[8]。因此，本研究以桃葉幼嫩莖段為材料，獲取桃葉衛(wèi)矛莖段愈傷組織誘導(dǎo)、分化及生根的最佳培養(yǎng)基組合，建立高效莖段愈傷組織再生體系，以期為桃葉衛(wèi)矛優(yōu)株繁育提供理論支持，為研究遺傳轉(zhuǎn)化體系提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇蒙樹生態(tài)科技園2016年自沈陽市引種的高2～3 m、胸徑2～4 cm、生長健壯、樹形優(yōu)美、無病蟲害的桃葉衛(wèi)矛優(yōu)良單株為材料，采集當(dāng)年生幼嫩枝條。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將采集的當(dāng)年生莖段，去掉葉片置于組培瓶中，用醫(yī)用紗布蒙上瓶口，自來水下沖洗30 min后放在超凈工作臺中，75%的酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～5次后，分別用20%的次氯酸鈉和0.10%的升汞進(jìn)行消毒處理，處理時間為8、10、12 min，消毒處理完成后再次用無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸水后，接種到MS+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基中。每個處理接種15個外植體，重復(fù)3次。7天后觀察染菌和萌芽情況。

1.2.2 培養(yǎng)條件 溫度為(25±5)℃，光照強(qiáng)度為2000～2200 lx，光處理時間為12～14 h/d，暗處理時間為10～12 h/d。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo) 啟動培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間待腋芽萌發(fā)后，將新生幼苗剪成約1 cm的莖段分別接種于不同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即6-BA濃度為0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA濃度為0、0.05、0.10 mg/L的正交組合。每個處理接種15個外植體，重復(fù)3次，觀察愈傷組織分化情況。

1.2.4 不定芽分化誘導(dǎo) 誘導(dǎo)出愈傷組織后，將愈傷組織分別接種于不同不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即6-BA濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/L，NAA濃度分別為0.05、0.10、0.15 mg/L。每個處理接種15個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)觀察不定芽誘導(dǎo)情況。

1.2.5 繼代增殖培養(yǎng) 選取3～4 cm的無菌苗，轉(zhuǎn)接到不同繼代增殖培養(yǎng)基中，即6-BA濃度分別為0.15、1.0、2.0 mg/L，NAA濃度分別為0.10、0.15、2.0 mg/L。每個處理接種15株，3次重復(fù)。20天后統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)和株高差。

1.2.6 生根誘導(dǎo) 誘導(dǎo)出不定芽后，將不定芽分別接種于不同生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，IBA濃度分別為0.1、0.3、0.4、0.5 mg/L，NAA濃度分別為0.1、0.2、1.0 mg/L。另外以添加0.3 g/L或不添加碳粉探索碳粉對生根的影響。每個處理接種15個外植體，重復(fù)3次培養(yǎng)觀察生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

啟動培養(yǎng)基培養(yǎng)20天后統(tǒng)計(jì)污染率與腋芽萌芽率；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、愈傷組織生長狀況；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率、不定芽苗高、不定芽生長狀況；生根誘導(dǎo)30天后統(tǒng)計(jì)生根率、平均生根數(shù)、平均生根長度。將收集到的數(shù)據(jù)利用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體消毒效果的影響

同一消毒劑，消毒時間影響消毒效果。試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，處理1污染率與其他處理下的污染率存在顯著性差異。處理6污染率最低，未出現(xiàn)污染情況，消毒效果最好，但其頂芽傷害程度嚴(yán)重，導(dǎo)致腋芽萌芽率最低，其他處理消毒效果無明顯差異。處理3腋芽萌芽率最高，可達(dá)96%，其污染率低，為2%?？紤]腋芽萌芽率為主要選擇因素、兼顧污染率時，選擇20%的次氯酸鈉消毒處理12 min作為桃葉衛(wèi)矛莖段最適消毒處理。

表1 消毒劑種類及消毒時間對桃葉衛(wèi)矛外植體的影響

2.2 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比對愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比均能利用莖段誘導(dǎo)出愈傷組織，但其誘導(dǎo)率不同，生長狀況不同。9種植物生長調(diào)節(jié)劑配比方案中，處理6愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為80.00%，愈傷面積大、生長快（圖1A）；處理9下的愈傷組織誘導(dǎo)率為53.33%，愈傷不明顯、生長慢、顏色褐色（圖1B）；處理2愈傷組織誘導(dǎo)率為48.89%，愈傷面積小、生長慢、顏色變?yōu)楹稚▓D1C）；其他處理愈傷誘導(dǎo)效果差，愈傷速度慢，誘導(dǎo)率均低于40.00%。因此，桃葉衛(wèi)矛利用莖段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比方案為1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

圖1 桃葉衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)情況

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響

2.3 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比對不定芽誘導(dǎo)效果的影響

表3結(jié)果表明，不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比均能誘導(dǎo)出不定芽，而不定芽誘導(dǎo)率及生長情況受植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比影響。處理1不定芽分化率達(dá)91.11%，不定芽分化明顯、生長快、幼苗健壯（圖2A）；處理5不定芽誘導(dǎo)率為66.67%，分化較為明顯，生長慢、幼苗細(xì)弱（圖2B）；處理4不定芽誘導(dǎo)率為61.59%，分化較為明顯、生長緩慢、幼苗矮?。▓D2C）。綜上可得，利用愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比方案為0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。

圖2 桃葉衛(wèi)矛不定芽分化情況

表3 植物植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽誘導(dǎo)效果的影響

2.4 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比對繼代增殖的影響

不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比對桃葉衛(wèi)矛繼代增殖結(jié)果有不同的影響（圖3A～B）。由表4可以看出，處理5增殖倍數(shù)最高，為6.0倍，但NAA濃度過高會使得苗木之間的株高差較大，降低了苗木的一致性，不利于后續(xù)的苗木培育。處理6由于NAA濃度高于6-BA濃度，繼代苗只進(jìn)行株高生長，幾乎不進(jìn)行分化，其增殖倍數(shù)低于1.0。處理4繼代增殖倍數(shù)為6.0倍，株高差為0.1 cm，適合用于桃葉衛(wèi)矛繼代增殖。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑配比處理對繼代培養(yǎng)的影響

圖3 桃葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)繼代和生根情況

2.5 不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑配比及碳粉對組培苗生根的影響

培養(yǎng)基中IBA濃度為0.1 mg/L時，添加碳粉可增加生根長度（表5，圖3C），其生根長度是同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度下未添加碳粉的處理的1倍以上（圖3D）；當(dāng)IBA濃度逐漸增加時，添加碳粉的平均生根條數(shù)小于未添加碳粉的處理。處理1、處理3、處理4組培苗均不生根；處理8生根條數(shù)最多，且長度最長。因此選擇1/2MS+IBA0.3 mg/L為桃葉衛(wèi)矛最適生根培養(yǎng)基。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對生根的影響

3 結(jié)論

本研究系統(tǒng)地從外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽芽誘導(dǎo)、繼代增殖、生根等方面對桃葉衛(wèi)矛組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了深入研究，最終得出桃葉衛(wèi)矛最佳消毒方案為：20%的次氯酸鈉消毒處理12 min，污染率為2%，腋芽萌發(fā)率為96%；莖段愈傷組織最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；利用愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比方案為0.5 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.00 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+3.0 mg/L IBA。

4 討論

利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立無性繁殖體系的前提是建立無菌體系，因此保證外植體低污染率對建立組培體系十分重要[9]。而在外植體消毒過程中所選單株不同、采集部位不同、采集時間不同、消毒時間不同均可導(dǎo)致消毒效果存在一定差異[10]。樊祥義等[11]在對金葉桃葉衛(wèi)矛外植體消毒研究中得出最佳的外植體為莖段，最佳消毒劑為0.1%升汞，最佳消毒時間為6 min，其污染率為10%、腋芽萌發(fā)率為81.1%。余慧等[12]對歐洲衛(wèi)矛組織培養(yǎng)研究得出，以歐洲衛(wèi)矛葉片為外植體時，最佳消毒劑為3%次氯酸鈉，最佳消毒時間為18 min，其污染率為12.95%、葉片成活率為81.26%。袁云香等[13]研究表明，小果衛(wèi)矛以嫩莖為外植體時最佳消毒劑為0.1%升汞，最佳滅菌時間為15 min，其污染率為2%、腋芽萌發(fā)率為92.33%。趙麗蒙等[14]研究得出衛(wèi)矛莖段最佳消毒方法為0.1%升汞消毒8 min并加入2滴吐溫-20，其污染率為17.67%、腋芽萌發(fā)率為59.67%，從其研究結(jié)果可以看出，此方法腋芽萌發(fā)率低，在消毒過程中消毒劑對外植體損傷明顯。李軍正等[15]研究表明，庫普曼衛(wèi)矛以葉片為外植體時的最佳消毒劑為0.1%升汞，消毒時間為5 min，其污染率為僅為4.6%，報道中未見腋芽萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)。從上述研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，以0.1%的升汞為消毒劑時，其污染率2%～17.67%，腋芽萌發(fā)率為59.67%～92.33%，而在本研究中，0.1%升汞滅菌12 min時腋芽萌發(fā)率僅為76%；以3%次氯酸鈉為消毒劑時，其污染率為12.95%，葉片成活率為81.26%，而在本研究中，20%的次氯酸鈉消毒處理12 min，污染率僅為2%，腋芽萌發(fā)率可達(dá)96%，在有效降低污染率的同時最大限度地降低了消毒劑對外植體的損傷。

植物生長調(diào)節(jié)劑對植物愈傷組織的誘導(dǎo)與分化過程具有重要作用，用于愈傷組織誘導(dǎo)與分化的植物生長調(diào)節(jié)劑通常為2,4-D、NAA、6-BA等[16]。袁云香等[17]以陜西衛(wèi)矛幼莖為外植體，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用正交試驗(yàn)研究了不同種類、濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑及其組合對陜西衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；而以小果衛(wèi)矛的嫩莖為外植體，研究不同植物調(diào)節(jié)劑種類及濃度對其愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果表明，最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D。胡麗娟[18]研究表明，陜西衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)方案為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。上述研究結(jié)果表明，同一種植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度及不同植物生長調(diào)節(jié)劑間的配比對衛(wèi)矛屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)與分化產(chǎn)生效果不同。而目前暫未見桃葉衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)相關(guān)研究報道，本研究為桃葉衛(wèi)矛以莖段為材料誘導(dǎo)愈傷組織提供最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比方案。

利用桃葉衛(wèi)矛不同的外植體如成熟胚、腋芽[19]等進(jìn)行組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)研究已經(jīng)取得了一定進(jìn)展，但在繼代增殖過程中桃葉衛(wèi)矛仍存在增殖倍數(shù)低、生長狀況不佳的問題，嚴(yán)重影響工廠化育苗效率。吳建華等[20]篩選出桃葉衛(wèi)矛增殖培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，增殖倍數(shù)為3.6，生根培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L IBA，平均生根數(shù)為3。卜祥潘等[21]研究得到，火焰衛(wèi)矛不定芽最佳增殖培養(yǎng)基為DKW+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA，其增殖倍數(shù)為3.73，最佳生根培養(yǎng)基為1/4WPM+IBA 2.0 mg/L，平均生根數(shù)為2.73。研究結(jié)果表明，衛(wèi)矛屬植物繼代增殖倍數(shù)約為3～4之間，組培生根苗平均生根數(shù)為2～3之間，本試驗(yàn)通過調(diào)節(jié)植物生長調(diào)節(jié)劑配比，將桃葉衛(wèi)矛繼代苗增殖倍數(shù)提升至6倍，將平均生根數(shù)提升至5，大幅提升了桃葉衛(wèi)矛繼代苗增殖生產(chǎn)效率。

植物利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立再生體系一般有器官再生途徑和體細(xì)胞胚再生途徑。器官再生途徑是指植物在適宜的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生不定芽和不定根等器官，再形成完整植株[22]。體細(xì)胞胚再生途徑是指體細(xì)胞胚發(fā)生經(jīng)歷與合子胚相似的階段，形成兩極性的體細(xì)胞胚，然后形成完整的植株[23]；體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)，但體細(xì)胞胚誘導(dǎo)對材料要求較高、培養(yǎng)環(huán)境難以控制、誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生較為困難，誘導(dǎo)率非常低[24]，器官再生途徑對材料要求低，培養(yǎng)環(huán)境可控，誘導(dǎo)率高，并能較好地保持母體遺傳性[25]。本研究以桃葉衛(wèi)矛器官再生為途徑建立桃葉衛(wèi)矛無性繁殖完整體系。而在研究過程中筆者發(fā)現(xiàn)利用同一植物調(diào)節(jié)劑配比方案進(jìn)行多次繼代增殖會影響繼代增殖率以及生根效果，同時在愈傷組織誘導(dǎo)過程中愈傷組織存在褐化問題需要繼續(xù)開展相關(guān)研究工作。此外，桃葉衛(wèi)矛根部與其他植物根相較而言具有乳白色、生長速度慢、缺乏韌性等缺點(diǎn)，上述問題暫未見相關(guān)報道解決。