混合鹽堿脅迫對(duì)紫花苜蓿的生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的影響

王曉春，楊天輝，王 川，楊煒迪，高 婷

（寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750002）

0 引言

土壤鹽漬化及次生鹽漬化是阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育的非生物逆境之一。在鹽堿脅迫下，植物建植困難、生長(zhǎng)緩慢、黃化早衰、品質(zhì)下降等問(wèn)題[1]，對(duì)全球的土地利用率和作物生產(chǎn)都有影響。中國(guó)鹽堿地，多是鹽化和堿化協(xié)同作用對(duì)植物產(chǎn)生傷害。紫花苜蓿是中等耐鹽堿豆科牧草，根系發(fā)達(dá)，固氮能力強(qiáng)，有較強(qiáng)的耐寒、耐旱、耐鹽堿和再生能力[2]。營(yíng)養(yǎng)價(jià)值居各類牧草之首，是改良鹽堿地可選的草種之一。寧夏地處中國(guó)西北內(nèi)陸，土壤鹽堿化嚴(yán)重，是優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿主產(chǎn)區(qū)之一。選育耐鹽堿苜蓿品種，能擴(kuò)大種植面積，提高鹽漬化土地的利用率，對(duì)畜牧業(yè)、生態(tài)都具有重要的意義。目前對(duì)于紫花苜蓿耐鹽堿的研究多集中在種子萌發(fā)階段和以中性鹽NaCl開(kāi)展的脅迫[3-9]，而在苜蓿苗期以混合鹽堿開(kāi)展脅迫研究的相對(duì)較少。本研究以混合鹽堿溶液在苜蓿苗期開(kāi)展脅迫，通過(guò)對(duì)苜蓿20個(gè)品種的生長(zhǎng)指標(biāo)和10個(gè)品種的生理指標(biāo)測(cè)定分析，研究混合鹽堿脅迫下苜蓿生長(zhǎng)和生理的變化規(guī)律，以期為苜蓿開(kāi)展耐鹽堿鑒定評(píng)價(jià)及耐鹽堿機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料詳見(jiàn)表1，多數(shù)在種子萌發(fā)期經(jīng)NaCl鑒定[10]是較耐鹽的紫花苜蓿品種（系）。

表1 供試紫花苜蓿種質(zhì)信息

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019年在寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究所基地溫棚進(jìn)行。將苜蓿種子播種于無(wú)孔塑料花盆（口徑21 cm，底徑11.3 cm，高12 cm），以細(xì)砂和蛭石做基質(zhì)。10天后間苗，每盆留有健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的發(fā)芽苗15株。待苗生長(zhǎng)到三葉期進(jìn)行混合鹽堿（NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3的摩爾比為1:1:1:1）脅迫。按每盆土干重的0.0%(CK)、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%稱量混合鹽，用一定量的自來(lái)水溶解為鹽溶液，經(jīng)測(cè)量鹽溶液pH 9.8～10.0，鹽溶液同時(shí)產(chǎn)生鹽堿脅迫，視各濃度鹽溶液堿度一致，差異主要由鹽脅迫引起。每處理9盆，每隔10天補(bǔ)充10 mL營(yíng)養(yǎng)液，土壤表面出現(xiàn)干裂就補(bǔ)充水分至飽和。

1.3 測(cè)定內(nèi)容與方法

鹽堿脅迫15天后統(tǒng)計(jì)成活率。15、30天定株測(cè)量植株地上部分高度，取平均值記為株高。30天后，從每處理選擇10株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，用游標(biāo)卡尺測(cè)量根頸處主根直徑記為根粗，直尺測(cè)量主根系根頸到根尖的長(zhǎng)度記為根長(zhǎng)；每處理隨機(jī)取15株植株，5株為一組，分3組，在根頸處用剪刀將地上、地下部分分開(kāi)，恒溫箱烘干地上、地下部分，分別稱重。

鹽脅迫10天后，每個(gè)處理取15株頂部嫩葉作為混合樣，放入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定，脯氨酸(Pro)含量采用磺基水楊酸法測(cè)定，可溶性糖(SS)含量測(cè)定采用苯酚比色法測(cè)定，葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)采用分光光度計(jì)法測(cè)定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用四氮唑藍(lán)(NBT)法測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測(cè)定[11]。測(cè)定時(shí)每個(gè)處理重復(fù)3次。

從供試的20個(gè)品種中選擇長(zhǎng)勢(shì)較好的10個(gè)品種測(cè)定生理指標(biāo)，從而分析鹽堿脅迫對(duì)較耐鹽堿品種生理的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件整理數(shù)據(jù)并制圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析（Duncan法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合鹽堿脅迫對(duì)苜蓿苗期生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

隨著鹽濃度的遞增，20個(gè)苜蓿品種的株高均呈規(guī)律性變化（表2）。在0.3%的鹽濃度處理下，株高最高。隨著鹽濃度的增加(0.6%、0.9%)，株高下降，但仍高于對(duì)照，當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)株高最低，表明低、中濃度的鹽堿溶液促進(jìn)了苜蓿植株的生長(zhǎng)。

表2 20個(gè)苜蓿品種在鹽堿脅迫下的株高 cm

對(duì)成活率、根粗等指標(biāo)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。20個(gè)苜蓿品種的成活率與根粗2個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)相對(duì)較低(1.8%～14.0%)，而根長(zhǎng)、地上、地下生物量3個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)較高(14.7%～36.3%)。成活率、根粗隨著鹽濃度的增加，變異系數(shù)均在1.2%的鹽濃度下最高。根長(zhǎng)、地上和地下生物量的變異系數(shù)在0.0%和1.2%時(shí)均高于其他處理。在鹽濃度為0.3%、0.6%、0.9%時(shí)，20個(gè)苜蓿品種都保持了較高的成活率，相對(duì)成活率分別為96.1%、94.9%、91.9%，但當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，相對(duì)成活率降為85.1%，顯著低于其他處理。

根系是植物與土壤直接接觸的器官，土壤中鹽堿的脅迫最先對(duì)根系產(chǎn)生影響。由表3可知，根粗、根長(zhǎng)在鹽濃度為1.2%時(shí)顯著低于其他處理(P<0.05)。地上生物量與地下生物量的變化一致，均在0.3%鹽濃度處理下最高，變化規(guī)律同株高。

表3 鹽堿脅迫下苜蓿成活率、根粗、根長(zhǎng)、地上、地下生物量的變化

2.2 混合鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生理指標(biāo)的影響

2.2.1 混合鹽堿脅迫下脯氨酸(Pro)、可溶性糖(SS)、丙二醛(MDA)含量的變化 不同苜蓿品種在不同濃度的鹽處理下各生理指標(biāo)變化不同。10個(gè)苜蓿品種葉片Pro、SS、MDA含量在1.2%鹽處理下最高（圖1），且與其他處理差異顯著。而在其他4個(gè)鹽濃度處理下，Pro、SS、MDA含量在苜蓿品種間變化差異較大。葉片Pro含量由大到小依次為0.3%、0.9%、0.0%、0.6%的鹽處理，而SS的含量為0.6%、0.3%、0.9%、0.0%的順序，MDA含量則為0.9%、0.0%、0.6%、0.3%。

圖1 鹽堿脅迫對(duì)苜蓿葉片脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量的影響

2.2.2 混合鹽堿脅迫下葉綠素含量及抗氧化酶活性的變化 在不同濃度的鹽處理下，10個(gè)苜蓿品種葉片的葉綠素a、b含量變化一致。但總?cè)~綠素含量(Chla+Chlb)在不同鹽處理下，品種間變化不同（表4）。在0.3%的鹽濃度脅迫下‘耐鹽’、‘德國(guó)大葉’、‘敖漢’、‘固原紫花’、‘中苜1號(hào)’的葉綠素含量最高，當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)‘耐鹽’、‘巖石’、‘德國(guó)大葉’、‘固原紫花’、‘鹽寶’的葉綠素含量最低，而其他品種在不同濃度鹽堿下葉綠素含量變化無(wú)規(guī)律。

表4 10個(gè)苜蓿品種在鹽堿脅迫下的葉片葉綠素含量 mg/g

在不同濃度鹽處理下，10個(gè)苜蓿品種葉片SOD、POD、CAT的活性變化在品種間有差異，但整體呈現(xiàn)出一定的規(guī)律（表5）。SOD活性在0.9%、0.6%、1.2%的處理下顯著高于0.0%和0.3%的處理；POD活性在鹽濃度0.9%和1.2%脅迫下顯著高于其他處理；CAT活性在1.2%鹽脅迫下最高，且與其他處理差異顯著。由此可見(jiàn)，苜蓿葉片抗氧化酶SOD、POD、CAT活性均在鹽濃度1.2%的處理下變化突出，顯著高于對(duì)照。

表5 鹽堿脅迫下苜蓿葉片SOD、POD、CAT活性

3 結(jié)論

當(dāng)混合鹽濃度為1.2%時(shí)，鹽堿脅迫對(duì)苜蓿苗期的生長(zhǎng)及生理變化影響較突出，1.2%的混合鹽是開(kāi)展苜蓿苗期耐鹽堿評(píng)價(jià)及耐鹽機(jī)理轉(zhuǎn)錄組、代謝組等研究的適宜濃度，但不建議以生理指標(biāo)直接做為苜蓿耐鹽堿評(píng)價(jià)指標(biāo)。因?yàn)楫?dāng)受到鹽堿脅迫時(shí)，苜蓿體內(nèi)各生理指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化，與脅迫時(shí)間緊密聯(lián)系，同時(shí)各生理指標(biāo)在苜蓿品種間存在差異，無(wú)法直接通過(guò)生理指標(biāo)評(píng)價(jià)不同苜蓿材料的耐鹽堿性。

4 討論

4.1 混合鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)的影響

各苜蓿品種在不同鹽濃度的鹽堿脅迫下相對(duì)成活率都很高，說(shuō)明苜蓿只要成功萌發(fā)、扎根就會(huì)相對(duì)耐鹽堿。而李波等[12]以NaHCO3對(duì)4個(gè)苜蓿品種苗齡4周幼苗開(kāi)展脅迫發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽濃度為150 mmol/L（約1.35%）時(shí)，4個(gè)品種成活率僅16.7%。而本研究以1.2%的混合鹽脅迫2周齡的幼苗，20個(gè)苜蓿品種平均成活率達(dá)81.3%，遠(yuǎn)高于前者，結(jié)果的不同有可能是堿性鹽NaHCO3對(duì)苜蓿幼苗的傷害大于混合鹽引起的。

在各梯度混合鹽堿脅迫下，苜蓿株高與地上、地下生物量的變化規(guī)律一致。均在鹽濃度為0.3%的鹽堿脅迫下最高，0.6%、0.9%時(shí)依次降低，對(duì)照(0%)與1.2%鹽處理下最低。這個(gè)變化規(guī)律說(shuō)明1.2%濃度的鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)、生物量的積累有阻礙，與對(duì)照相比，其他濃度鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用。尤其是中、高濃度的鹽(0.6%、0.9%)堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)、生物量都有促進(jìn)作用的結(jié)果，說(shuō)明低、中濃度的鹽堿脅迫促進(jìn)了苜蓿苗期的生長(zhǎng)，苜蓿相對(duì)耐鹽堿。這個(gè)結(jié)論與田小霞[13]、劉晶[14]等的研究結(jié)論差距較大。田小霞以NaCl脅迫苜蓿屬132份樣本幼苗，結(jié)果顯示當(dāng)鹽濃度為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%時(shí)，苗高都低于對(duì)照(0.0%)，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)只有抑制作用。而劉晶認(rèn)為低濃度鹽脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。根粗、根長(zhǎng)在鹽濃度為1.2%的鹽堿脅迫下最低，而在其他處理下差異不明顯，反映了在此濃度脅迫下，苜蓿生長(zhǎng)受到明顯的抑制。地下、地上生物量的變化與株高相對(duì)應(yīng)，在0.3%、0.6%、0.9%濃度的鹽堿脅迫下，都高于對(duì)照。與張曉磊等[15]的結(jié)論“低濃度混合鹽堿對(duì)紫花苜蓿根系的生長(zhǎng)影響不顯著或具有一定的促進(jìn)作用，高濃度鹽堿脅迫抑制根系的生長(zhǎng)”一致。

4.2 混合鹽堿脅迫下苜蓿生理指標(biāo)的變化

Pro和SS是植物遭受逆境脅迫時(shí)大量積累的小分子有機(jī)化合物，通過(guò)滲透調(diào)節(jié)降低水勢(shì)，維持較高的滲透壓，保證細(xì)胞的正常生理功能。MDA含量變化在植物逆境生理研究中也非常重要，可通過(guò)MDA含量的變化間接評(píng)價(jià)植物在高鹽環(huán)境下膜系統(tǒng)的傷害程度。

10個(gè)苜蓿品種的生理指標(biāo)分析結(jié)果顯示，不同的生理指標(biāo)在苜蓿品種間變化有差異。本研究以多數(shù)苜蓿品種變化規(guī)律分析鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生理指標(biāo)的影響。在不同濃度混合鹽處理下，Pro、SS、MDA含量的變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律，均在1.2%鹽處理下最高，而在其他處理下差異不明顯。說(shuō)明1.2%的鹽濃度對(duì)苜蓿細(xì)胞內(nèi)含物有影響。楊科等[16]以混合鹽堿脅迫燕麥幼苗，隨著鹽濃度升高，MDA含量增加，Pro和SS累積，但當(dāng)鹽濃度為100～200 mmol/L時(shí)，有的品種的Pro和SS含量下降。江超等[17]以NaCl對(duì)2個(gè)苜蓿品種開(kāi)展脅迫，隨著鹽濃度和天數(shù)的增加，苜蓿根部Pro、MDA含量均呈現(xiàn)明顯的先升高后降低的趨勢(shì)，且高鹽溶液升高的趨勢(shì)要明顯大于低鹽溶液升高的趨勢(shì)。時(shí)麗冉等[18]以Na2CO3脅迫水稻種子，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是高濃度鹽還是低濃度鹽都使幼苗中的MDA含量增大、Pro含量升高。以上結(jié)論都與本研究結(jié)果有差異，結(jié)合苜蓿生長(zhǎng)指標(biāo)，本研究認(rèn)為當(dāng)鹽濃度為1.2%時(shí)，鹽堿脅迫對(duì)苜蓿生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，所以在此濃度下，Pro、SS含量積累，MDA含量增加。

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用的主要色素。在逆境條件下，植物對(duì)脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)為光合作用下降和光合色素含量降低[19]。在本研究中，有的苜蓿品種在混合鹽堿脅迫下，隨著鹽濃度的遞增，葉綠素含量先升高后下降（鹽濃度為0.3%時(shí)最高，1.2%時(shí)最低），與苜蓿生物量變化相對(duì)應(yīng)。而有的品種在不同濃度鹽堿脅迫下，葉綠素含量變化無(wú)規(guī)律。李杰等[20]研究結(jié)論“低濃度的鹽堿脅迫促進(jìn)了苜蓿葉綠素的積累，但中高濃度鹽堿脅迫致使葉綠素含量下降”與本研究部分苜蓿品種葉綠素含量變化一致。但有的研究者認(rèn)為，隨著鹽濃度升高，苜蓿葉綠素含量下降[21-22]，也有人認(rèn)為葉綠素的量只是反映了高鹽環(huán)境中光合作用的強(qiáng)弱，不能直接反映植物的耐鹽性[23]，這與本研究中有些苜蓿品種在不同濃度鹽堿脅迫下葉綠素含量變化無(wú)規(guī)律的結(jié)果相同。

研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫下植物葉片中SOD、POD和CAT活性增加，或者嚴(yán)重脅迫時(shí)呈先增加后降低的規(guī)律[20,23-24]。本研究中苜蓿品種的抗氧化酶活性在鹽濃度為1.2%時(shí)顯著高于其他濃度處理，說(shuō)明此濃度的鹽脅迫對(duì)有些苜蓿品種葉片抗氧化系統(tǒng)有影響。張喜斌等[25]開(kāi)展6個(gè)苜蓿品種的苗期耐鹽性鑒定，在300 mmol/L（約1.76%）NaCl脅迫下SOD、POD活性均出現(xiàn)了下降，但CAT活性卻有不同程度的上升。時(shí)麗冉[26]以混合鹽堿對(duì)7個(gè)小黑麥品種進(jìn)行脅迫，發(fā)現(xiàn)SOD、POD活性增高，而CAT在有的品種上表現(xiàn)為在低濃度鹽脅迫下升高、在中高濃度鹽脅迫下降低，有的品種卻一直上升。楊升[27]以NaCl脅迫沙棗樹(shù)幼苗，當(dāng)鹽濃度為300 mmol/L（約1.76%）時(shí)SOD活性明顯降低，而在其他濃度下與對(duì)照無(wú)顯著差異，認(rèn)為SOD可能不是鹽脅迫下沙棗幼苗的主要抗氧化保護(hù)酶，也可能SOD只在鹽脅迫初期（<40天）活性提高，對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)起保護(hù)作用。這都與本研究結(jié)果不同，由此可見(jiàn)，抗氧化酶活性的變化較敏感，在植物種類、品種間差異較大。

植物在鹽堿性環(huán)境下，通過(guò)各種生理變化來(lái)維持正常生命活動(dòng)，其作用機(jī)理尚不明確。本研究以混合鹽堿模擬大田鹽堿環(huán)境，比較不同鹽度梯度下苜蓿苗期的生長(zhǎng)與生理指標(biāo)的變化，可為耐鹽堿苜蓿品種的選育及今后開(kāi)展苜蓿耐鹽堿機(jī)制研究提供參考。