分子標(biāo)記輔助選擇改良水稻不育系‘荃211S’白葉枯病的抗性

黃艷玲，嚴 志，申廣勒，王 慧，張從合，楊 韋，陳 琳，張云虎，龐戰(zhàn)士，喬 木，李方寶，楊 力

（安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜交稻新品種創(chuàng)制重點實驗室，合肥 230088）

0 引言

水稻是人類賴以生存的主要糧食作物之一，也是中國人口的主要口糧。隨著全球氣候變暖，化肥使用過量，水稻在生產(chǎn)過程中經(jīng)常會受到各種病蟲侵害，白葉枯病是其中最主要的病害之一，在世界很多國家各稻區(qū)均有發(fā)生。白葉枯病對水稻產(chǎn)量影響很大，苗期發(fā)生病害影響水稻植株營養(yǎng)生長；孕穗期發(fā)生病害造成水稻空癟粒、莖稈變軟、進而引起倒伏導(dǎo)致水稻嚴重減產(chǎn)，甚至顆粒無收。隨著水稻白葉枯病的逐年加重，種植水稻的風(fēng)險也越來越高。然而少量化學(xué)農(nóng)藥的使用對病害防治效果較差，過量農(nóng)藥又會造成環(huán)境污染。育種實踐證明，選育和種植攜帶白葉枯病抗性基因的水稻品種是控制白葉枯病害發(fā)生的最經(jīng)濟和有效的方法。截至目前，至少定位了水稻白葉枯病抗性基因34個，其中10個基因成功克隆，大多數(shù)抗白葉枯基因來自栽培和野生種質(zhì)資源[1]。

Xa23是迄今全球最廣、抗性最強的抗白葉枯基因，該基因來源于普通野生稻，位于第11號染色體上，含有Xa23基因的品種其全生育期內(nèi)高抗白葉枯病[2-3]。秦剛等[4]研究將Xa23基因?qū)攵i稻、粳稻及不育系等不同遺傳背景中，得出Xa23基因抗性遺傳強，導(dǎo)入效應(yīng)好，為選育高抗白葉枯病組合提供基因資源；夏志輝等[5]利用10個來源于菲律賓的白葉枯病菌株對明確含有抗白葉枯基因和高感白葉枯菌株進行鑒定，再次證明，Xa23基因抗譜最廣、強度最強。目前，Xa23基因已廣泛應(yīng)用于水稻育種，楊德衛(wèi)等[6]利用Xa23基因改良早稻恢復(fù)系‘東南恢012’，篩選出7份抗白葉枯的恢復(fù)系材料；李進波等[7]利用該基因改良了雜交親本‘9311’和‘1826’白葉枯的抗性，從中篩選出恢復(fù)系‘C6201’、‘C6271’、‘C6351’；倪大虎等[8]利用分子標(biāo)記輔助選擇將抗稻瘟病Pi9基因和抗白葉枯Xa23基因聚合到同一優(yōu)良株系獲得攜帶雙基因株系L10-L13；周鵬等[9]利用含有Xa23的恢復(fù)系‘R659’為抗性供體，異大穗型恢復(fù)系‘?；?328’為受體，培育了2份含Xa23基因的純合改良株系‘EMR402’、‘EMR403’；鄧家團等[10]通過回交轉(zhuǎn)育方法把Xa23基因快速導(dǎo)入新的恢復(fù)系材料中，使其高抗白葉枯且具有良好的恢復(fù)性及增產(chǎn)潛力；劉毅等[11]利用Xa23基因與‘滬旱1B’雜交、回交，提高了節(jié)水抗旱親本白葉枯病抗性。上述導(dǎo)入Xa23基因的水稻材料白葉枯抗性均有不同程度的提高。

‘荃211S’系安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司選育的特優(yōu)良不育系，該不育系具有配合力高、易制種、好繁殖等優(yōu)良特性；其所配組合高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗倒、早熟、耐高溫；目前，以‘荃211S’所配組合通過國家級、省級試驗的品種較多，市場占有率高；唯一不足之處就是白葉枯抗性還有待提高。因此，本研究為了改良‘荃211S’抗白葉病的特性，通過常規(guī)育種與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)相結(jié)合，將白葉枯病抗性基因Xa23導(dǎo)入‘荃211S’，選育出水稻白葉枯病抗性明顯增強的4個改良的不育株系，以期培育出更多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗白葉病的雜交新組合。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

所有試驗均在安徽荃銀高科股份有限公司分子育種中心及三亞和合肥試驗基地進行。

1.2 試驗材料

以含有Xa23基因CBB23（高抗白葉枯）為供體親本，以感白葉枯病兩系不育系‘荃211S’為受體和回交親本，通過雜交、自交等常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)改良‘荃211S’白葉枯病的抗性。

1.3 供試菌種

7個流行中國治病型白葉枯小種的病菌C1-C7由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；安徽省流行白葉枯病菌由安徽省農(nóng)科院植物保護研究所提供。

1.4 分子標(biāo)記輔助選擇

DNA提取采用SDS法，PCR擴增引物選擇與Xa23基因緊密連鎖的標(biāo)記RM206，序列為P1：5’-CCCATGCGTTTAACTATTCT-3’，P2：5’-CGTTCCAT CGATCCGTATGG-3’。PCR擴增方法參照NY/T1433-2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》，稍作調(diào)整。

1.5 白葉枯鑒定方法

白葉枯病的接種鑒定方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T28078-2011《水稻白葉枯病菌、水稻細菌性條斑病菌檢疫鑒定方法》[12]，鑒定的水稻材料播種于育秧盤，3次隨機重復(fù)，育秧苗長至3～4葉期進行接種；經(jīng)過大田常規(guī)育秧移栽，3次隨機重復(fù)，分蘗盛期進行接種。接種方法：用剪刀蘸取5×108/mL的白葉枯病菌液，葉尖剪去1～2 cm，每株剪3片葉，每重復(fù)接種10株，接種后21天，測量10張葉片的病斑長度，同時測量接菌葉片的平均長度，并根據(jù)病斑長度劃分病情指數(shù)和抗性類型（表1）。

表1 水稻白葉枯病病情分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性類型的劃分

1.6 改良‘荃211S’株系的育性

改良‘荃211S’的4個不育株系、‘荃211S’分別于2018年5月1日至6月10日播種，每10天播1期，共播種5期。始穗后每2天進行一次花粉鏡檢，每個不育系隨機選取10穗，用鑷子從穗的上、中、下部分別取一枚穎花的花藥，放入已滴有一滴1%KI-I2溶液載玻片進行染色，并去除花粉囊，使花粉粒不重疊，在顯微鏡下觀察；同時每天套袋5穗，記錄花粉敗育程度和套袋自交率。

1.7 改良‘荃211S’株系農(nóng)藝性狀的鑒定

2018年5月，對‘荃211S’和改良‘荃211S’的4個不育株系進行播種，栽插。并于抽穗期調(diào)查主要的農(nóng)藝性狀如：播始歷期、柱頭外露率等；10月份，進行室內(nèi)考種，主要考察：株高、穗長、每穴穗數(shù)、每穗穎花數(shù)等。

1.8 改良‘荃211S’株系所配組合農(nóng)藝性狀的鑒定

2019年5月，‘荃211S’及其改良‘荃211S’的4個株系分別與‘9311’（感白葉枯）進行雜交。所得的雜交組合與‘豐兩優(yōu)4號’進行比較試驗，種植規(guī)格為16.67 cm×26.67 cm，3次重復(fù)。10月份對所配的雜交組合進行農(nóng)藝性狀（株高、株型等）和豐產(chǎn)性狀（有效穗數(shù)，每穗總花數(shù)、結(jié)實率、千粒重等）的考察。

1.9 統(tǒng)計方法

采用DPS對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合改良‘荃211S’的選育過程

利用與抗白葉枯病目標(biāo)基因Xa23緊密連鎖的分子標(biāo)記RM206，對供體親本‘CBB23’和受體親本‘荃211S’進行PCR擴增分析，結(jié)果擴增出2條不同片段（圖1）。

圖1 RM206在供體親本和受體親本之間的多態(tài)性分析

2014年6月，以感病的‘荃211S’為受體親本和輪回親本，以含Xa23抗病基因的‘CBB23’為供體親本進行雜交、自交；同時利用分子標(biāo)記跟蹤抗病基因Xa23，并通過人工接種篩選抗白葉枯病的單株系，最終選育出綜合農(nóng)藝性狀好、不育系的育性轉(zhuǎn)換溫度低、白葉枯病抗性好的4個改良株系（QK211S-1、QK211S-2、QK211S-3、QK211S-4）。隨機選取改良‘荃211S’的4個單株系進行分子標(biāo)記檢測，均為陽性純合（圖2）。不育系‘荃211S’改良選育過程（圖3）。

圖2 含Xa23基因純合株系QK211S-1～QK211S-4的PCR分析

圖3 不育系‘荃211S’改良選育過程

2.2 改良‘荃211S’株系抗性鑒定結(jié)果

為了鑒定改良不育系‘荃211S’對白葉枯病的抗性，本研究采用7個有代表性的中國白葉枯病菌株和安徽省流行的白葉枯病菌株對供體親本‘CBB23’和受體親本‘荃211S’及4個改良‘荃211S’株系在抽穗期進行白葉枯病接種鑒定（見表2與圖4）。供體親本‘CBB23’表現(xiàn)出高抗或抗，抗性級別為0-1；改良‘荃211S’也表現(xiàn)出高抗或抗，抗性級別為0-2；‘荃211S’對HLJ72、ZH173、GD1358、LN57、JS49-6均表現(xiàn)出中感，抗性級別為5-6，其他3個菌株表現(xiàn)出感，抗性級別為7，結(jié)果表明所選育的4個改良‘荃211S’株系白葉枯病抗性較‘荃211S’明顯增強。

表2 ‘CBB23’、‘荃211S’及改良株系QK211S-1～QK211S-4對白葉枯病小種的抗性

圖4 ‘CBB23’、‘荃211S’及改良株系QK211S-1～QK211S-4的對白葉枯病抗性比較

2.3 改良‘荃211S’株系的田間育性鑒定

為了鑒定考察改良不育系的育性，2018年5月1日，改良‘荃211S’的4個株系和‘荃211S’進行分期播種，每10天播種1期，共5期。抽穗時對其進行育性觀測，每隔1天進行一次花粉鏡檢，同時每天套袋5穗，觀察花粉敗育程度和套袋自交率，并記錄每天平均溫度。鑒定結(jié)果：改良‘荃211S’的4個株系與‘荃211S’在合肥的不育期超過30天，日平均溫度高于23.5℃花粉鏡檢結(jié)果為少量典敗，套袋自交率為0，當(dāng)平均溫度降低到23.5℃以下超過3天時，15天后取剛出的小穗進行花粉鏡檢，花粉鏡檢結(jié)果多為染敗，少量可育花粉粒，表明育性在23.5℃以下時發(fā)生轉(zhuǎn)育。由此可見，4個改良不育株系與‘荃211S’的不育系育性穩(wěn)定，育性起點溫度在23.5℃。

2.4 改良‘荃211S’株系與‘荃211S’主要農(nóng)藝性狀的比較

改良‘荃211S’的4個株系播始歷期較親本‘荃211S’長1.39%～2.01%之外，差異達顯著水平，其他農(nóng)藝性狀似‘荃211S’，詳見表3。

表3 ‘荃211S’與改良株系QK211S-1～QK211S-4農(nóng)藝性狀的比較

‘荃211S’2019年3月，為考察改良‘荃211S’株系的配組情況，將改良‘荃211S’的4個株系、‘荃211S’分別與恢復(fù)系‘9311’進行雜交，雜交組合的主要農(nóng)藝性狀以及白葉枯抗病指數(shù)和抗病類型的比較見表4?！?11S’與‘9311’所配組合和改良‘荃211S’的4個株系與‘9311’所配組合在株高、有效穗、結(jié)實率、千粒重上均無明顯差異；改良‘荃211S’的4個株系與‘9311’所配組合理論產(chǎn)量較‘荃211S’與‘9311’所配組合增產(chǎn)0.09%～0.34%，但無明顯差異。

表4 ‘荃211S’、改良株系QK211S-1～QK211S-4所配組合與‘豐兩優(yōu)4號’農(nóng)藝性狀及白葉枯病鑒定的比較

續(xù)表4

改良‘荃211S’的4個株系與‘9311’所配組合在株高、每穗總粒數(shù)上顯著或極顯著低于‘豐兩優(yōu)4號’(ck)；而改良‘荃211S’的4個株系與‘9311’所配組合較‘豐兩優(yōu)4號’的有效穗顯著增加4.21%～4.91%，結(jié)實率顯著增加2.45-2.63%；改良‘荃211S’的4個株系與‘9311’所配組合理論產(chǎn)量較‘豐兩優(yōu)4號’增產(chǎn)4.24%～4.50%，差異達顯著水平。

‘荃211S’與‘9311’所配組合和‘豐兩優(yōu)4號’(ck)抗白葉枯病的級別分別為7級和5級，為感病品種；而改良‘荃211S’的4個株系與‘9311’所配組合的白葉枯抗性級別均為1，為抗性品種，抗性較‘荃211S’明顯增強。

3 討論與結(jié)論

抗病品種的應(yīng)用是農(nóng)作物病害綜合治理的重要途徑之一，選育抗病品種是關(guān)鍵。近年來，隨著分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的日益成熟，國內(nèi)開展了大量利用分子標(biāo)記輔助選育抗白葉枯病水稻新品種的研究[2-11]。羅彥長等[13]將抗白葉枯基因Xa23及Xa21導(dǎo)入三系不育系‘R106A’，提高白葉枯病抗性的同時拓寬了親本抗譜；鄭康樂等[14]證實將多個單抗性基因聚合，可以明顯增強被改良品種的白葉枯病抗性；趙天龍等[15]將抗白葉枯Xa23及Xa21導(dǎo)入‘明恢86’，再次證明聚合多基因白葉枯病抗性明顯增強；倪大虎等[16]聚合抗稻瘟病pi9和抗白葉枯Xa23及Xa21基因，選育出既抗白葉枯病又抗稻瘟病的株系；陳志偉等[17]利用優(yōu)質(zhì)不育系‘Y58S’、‘RGD-S’與含有Pi-2、Pi-1、Pi-kh、Xa23及Xa21的保持系‘M215B’雜交、復(fù)交，選育出抗稻瘟病和白葉枯病新的兩系不育系‘禾9S’；陳建民等[18]將水稻材料‘C750’中的白葉枯病基因Xa23基因和抗稻瘟病基因Pi9導(dǎo)入感病恢復(fù)系‘閩恢3139’中，使改良的‘閩恢3139’恢復(fù)系抗性和抗譜明顯增強；徐建龍等[19]以抗白葉枯病‘早粳G38’和‘秀水11’雜交，選育出聚合xa5和Xa3的3個晚粳品系，其抗性水平明顯強于雙親，抗譜也明顯拓寬，本研究以含有抗白葉枯病Xa23基因的‘CBB2’體親本導(dǎo)入異交結(jié)實率高的優(yōu)質(zhì)兩系光溫敏核‘荃211S’，提高了‘荃211S’白葉枯病抗性，這與羅彥長等[13]、鄭康樂等[14]、趙天龍等[15]研究結(jié)果一致。上述研究聚合抗病基因，拓寬抗譜，提高抗病能力，延長品種的生命周期。

然而，由于品種的抗病性受溫度、濕度、栽培措施、地形地貌以及病菌生理小種變異的影響，各稻區(qū)主栽品種由于是主基因和寡基因控制的抗病品種，推廣若干年后，其抗性便喪失。辜瓊瑤等[20]認為生態(tài)條件差異較大，形成不同致病種群，因而品種抗性喪失。為了使品種的抗病性穩(wěn)定、持久，就需要不斷挖掘抗性資源。多系品種或混合品種群體內(nèi)抗性資源的多樣性，不但增加品種對多種病菌小種的抗性，而且可以控制病原菌的發(fā)展和致病性的變異，從而延長品種的抗性[21]。

本研究以含有Xa23基因‘CBB23’為供體親本，以不育系‘荃211S’為受體親本和回交親本，通過雜交、自交、等常規(guī)育種技術(shù)結(jié)合分子標(biāo)記輔助技術(shù)，最終獲得了4個白葉枯病抗性改良的不育系，抗性鑒定級別為0-2，屬高抗或抗白葉枯病，抗性明顯增強；‘荃211S’鑒定抗性級別為5-7，屬中感或感白葉枯病。改良‘荃211S’株系所配組合白葉枯病的抗性級別為1，抗性明顯增強。改良‘荃211S’株系在合肥不育的天數(shù)超過30天，花粉徹底敗育，自交結(jié)實率為0，育性轉(zhuǎn)換溫度約在23.5℃，異交結(jié)實高，制種產(chǎn)量高且安全系數(shù)高。改良‘荃211S’株系與恢復(fù)系所配組合抗白葉枯的特性明顯增強，抗性級別為1；改良‘荃211S’株系與恢復(fù)系所配組合較‘豐兩優(yōu)4號’的產(chǎn)量顯著提高4.24%～4.50%。本研究改良了兩系不育系‘荃211S’不抗白葉枯的特性，減少了大田生產(chǎn)風(fēng)險，提高了其抵御白葉枯病害的能力。所獲得的具有Xa23基因的4個改良株系白葉枯病抗性與所用供體親本‘CBB23’抗性無明顯差異，改良的4個‘荃211S’的株系同‘荃211S’農(nóng)藝性狀相當(dāng)，白葉枯病的抗性明顯增強，可以直接在生產(chǎn)中應(yīng)用。