不同濃度的A-PRF 膜萃取液對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖及OPG 表達(dá)的影響

陳嘉彤 王雪松 金鼎

隨著生活水平的提高,越來越多的人們開始重視口腔健康,人們的思想觀念也從治療為主轉(zhuǎn)向預(yù)防為主。越來越多的口腔材料都應(yīng)用于臨床造福人類,A-PRF 膜也廣泛應(yīng)用于口腔臨床診療工作中,它作為一種富含生長因子的生物膜因制取方法便捷、取自自體血液、離心無排斥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)深受廣大醫(yī)生的喜愛,是一種天然纖維蛋白為基礎(chǔ)的生物材料,從不含抗凝劑的血液中收獲,無需任何人工生化修飾。A-PRF 膜對(duì)種植體周圍附著齦喪失具有很好的療效,可以很好的促進(jìn)急性外傷造成的鼓膜創(chuàng)口的愈合,促進(jìn)上頜竇的骨組織再生,也可以很好的治療牙周病導(dǎo)致的牙齦退縮［1-4］。A-PRF 膜還可以釋放大量的生長因子從而促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原,有助于牙周組織的愈合［5］。Bozkurt 研究通過對(duì)20 例患者應(yīng)用濃縮生長因子得出其有助于臨床上復(fù)雜性牙齦萎縮的治療［6］。本實(shí)驗(yàn)采取健康成人靜脈血制作A-PRF 膜,將A-PRF 膜放置于患者自身體外培養(yǎng)的牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),觀察各放置組內(nèi)人牙齦成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為及各組內(nèi)OPG 的表達(dá),具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 磷酸鹽緩沖液(PBS)(Solarbio)、胰蛋白酶消化液(Solarbio)、DMEM 低糖培養(yǎng)基(Solarbio)、無噬菌體低內(nèi)毒素胎牛血清(杭州四季青)、Vimentin(D21H3)XP Rabbit mAb(Cell Signaling Technology)、Goat anti-rabbit IgG(H+L)/FITC (Sigma,USA)、免疫熒光染色試劑盒(漢恒生物科技有限公司,上海)、OPG-ELISA 試劑盒(瑞齊生物科技有限公司,上海)、熒光顯微鏡 (正置,OLYMPUS)、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、CKX41 顯微鏡、MCO-15A 全自動(dòng)CO2細(xì)胞恒溫孵育箱(SANYO)、酶標(biāo)儀(BioTek,synergy 2)。

1.2 方法

1.2.1 牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與組織來源鑒定 人的牙齦組織取材于本院口腔頜面外科門診因有阻生智齒需要拔除、矯正牙齒過程中開窗牽引需要切除少量牙齦,或者口腔種植手術(shù)中需切除部分牙齦且牙齦沒有炎癥的健康患者,在取得患者知情同意后選用其牙齦組織用作培養(yǎng)來源,年齡18～26 歲。將門診所選用的健康牙齦作為HGF 原代培養(yǎng)來源,利用牙齦組織塊貼壁的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),培養(yǎng)液需要每2～3 天做一次更換,采用普通光學(xué)顯微鏡觀察人牙齦組織塊的生長情況以及HGF 細(xì)胞的爬出形態(tài)。選擇胰蛋白酶消化傳代法消化并且提純?nèi)搜例l成纖維細(xì)胞［7］。利用免疫熒光染色的方法對(duì)健康傳代的第3 代細(xì)胞進(jìn)行抗波形絲蛋白以及抗角蛋白染色鑒定細(xì)胞的來源。

1.2.2 制備A-PRF 膜萃取液并將A-PRF 膜與人牙齦成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng) A-PRF 膜制備方法：取2 份志愿者自身靜脈血10 ml,將其在無菌條件下進(jìn)行離心,1500 r/min 離心14 min。見圖1。離心后取得A-PRF生長因子凝膠,將凝膠進(jìn)行壓縮,制作A-PRF 膜。見圖2。將A-PRF 膜放置于存有5 ml 的DMEM 無菌培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行孵育。1 周后將培養(yǎng)基內(nèi)的培養(yǎng)液進(jìn)行收集,隨后進(jìn)行離心,采用無菌濾器進(jìn)行過濾去除細(xì)菌,而后取得A-PRF 膜萃取原液。本實(shí)驗(yàn)將這種原液濃度設(shè)定為100%濃度,而后用DMEM 培養(yǎng)基以不同濃度進(jìn)行稀釋,從而獲得10%、50%的A-PRF 生長因子提取液。將第3 代人牙齦成纖維細(xì)胞用酶聯(lián)免疫法傳代到含有蓋玻片的六孔板內(nèi),取濃度0、10%、50%、100%的A-PRF 提取液100 μl 分別加入到人牙齦成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),標(biāo)記為A 組、B 組、C 組、D 組,每組內(nèi)有7 個(gè)復(fù)孔。37℃的全自動(dòng)CO2恒溫孵育箱內(nèi)孵育24 h 后取出,倒置相差顯微鏡觀察人牙齦成纖維生物學(xué)形態(tài)。

圖1 自體血離心

圖2 制備A-PRF 膜

1.2.3 人OPG-ELISA 試劑盒檢測不同濃度PRF 膜對(duì)OPG 表達(dá)的影響 吸取不同組別培養(yǎng)基上清液置于離心管承裝并做好組別標(biāo)記。依照OPG-ELISA 試劑盒使用說明進(jìn)行操作。將標(biāo)記好的稀釋標(biāo)準(zhǔn)品用酶標(biāo)儀檢測各樣品孔的OD 值。從而利用各孔的吸光值得出相應(yīng)樣品的OPG 含量的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn),多組比較采用方差分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 利用組織塊貼壁的培養(yǎng)方法培養(yǎng)HGF,組織塊貼壁。見圖3。在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察,可見HGF 呈現(xiàn)梭形或者星形,細(xì)胞排列十分規(guī)則,呈束狀或旋渦狀。見圖4。用免疫熒光染色法鑒別HGF 組織的來源,抗角蛋白抗體染色結(jié)果無染色呈陰性,抗波形絲蛋白抗體染色呈現(xiàn)陽性,胞漿呈現(xiàn)熒光綠色,HGF 的細(xì)胞有明顯細(xì)長的偽足呈長梭形,胞核多呈橢圓形位于細(xì)胞的中央。見圖5。照相記錄HGF 的細(xì)胞形態(tài),證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞為來源于中胚層的纖維母細(xì)胞,具有HGF 的形態(tài)特點(diǎn)。

圖3 培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞

圖4 培養(yǎng)的人牙齦成纖維細(xì)胞(×40)

圖5 牙齦成纖維細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的免疫熒光染色(×400)

2.2 不同濃度A-PRF 膜對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞生長的影響 隨著A-PRF 膜萃取液濃度的增高牙齦成纖維生長密度增加,細(xì)胞數(shù)量明顯增多。見圖6。

2.3 不同濃度A-PRF 膜對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞OPG 表達(dá)的影響 HGF 在低濃度的生長因子萃取液刺激的條件下,OPG 表達(dá)水平隨著萃取液濃度的增高而不斷增加。經(jīng)不同濃度A-PRF 膜萃取液刺激后,四組的OPG 表達(dá)水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1,圖7。

表1 四組OPG 表達(dá)水平比較 (,pg/ml)

表1 四組OPG 表達(dá)水平比較 (,pg/ml)

注：四組比較,P<0.05

圖7 四組OPG 表達(dá)水平比較

3 討論

人牙齦成纖維細(xì)胞是牙周組織中的主體細(xì)胞,在牙周組織的保護(hù)及修復(fù)中占有重要的地位［8］。OPG 對(duì)骨組織吸收起抑制作用,抑制破骨細(xì)胞(OC)的分化、活化和成熟以及減少細(xì)胞數(shù)量［9］。本實(shí)驗(yàn)選用人牙齦成纖維組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)HGF,原代培養(yǎng)的細(xì)胞以組織塊為中心呈放射狀增長,細(xì)胞繼續(xù)傳代呈旋渦狀或放射狀走行,排列十分緊密且有極性［10］。采用不同濃度的A-PRF 膜萃取液刺激人牙齦成纖維細(xì)胞,觀察其生物學(xué)形態(tài)變化及OPG 的表達(dá)。隨著A-PRF 濃度的增加人牙齦成纖維細(xì)胞的生長密度亦隨之增加,OPG 的濃度也相應(yīng)增大,這使得真正具有溶骨作用的OC 數(shù)量大大減少,OPG 通過上述途徑起到了保護(hù)骨組織的作用。高濃度的A-PRF 膜萃取液可以通過支持促進(jìn)細(xì)胞傳代增殖、釋放生長因子從而成為一種生物愈合基質(zhì)［11］。有實(shí)驗(yàn)研究表明A-PRF 膜可以通過增加堿性磷酸酶的分泌促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖與分化［12］,這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。A-PRF 膜通過活化成骨相關(guān)的基因RUNX2 及骨鈣素的表達(dá)促進(jìn)HGF 的成骨過程［13］,這與本實(shí)驗(yàn)OPG 隨萃取液濃度的增加而表達(dá)增強(qiáng),共同證實(shí)了A-PRF 膜具有促進(jìn)骨組織愈合的能力。種植體周圍炎的患者經(jīng)過有效的潔治刮治等治療后應(yīng)用A-PRF 膜還能有效的促進(jìn)種植體周圍炎的愈合［14］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究A-PRF 可以有利于短期內(nèi)外傷脫位牙牙周膜愈合［15］。A-PRF 膜可以刺激體外牙髓干細(xì)胞的增殖,對(duì)于一些需要進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建的患兒聯(lián)合應(yīng)用抗生素具有很好的療效［16,17］。A-PRF 膜內(nèi)凝集的大量白細(xì)胞及生長因子也可以有效的治療拔牙創(chuàng)傷等原因引起的干槽癥［18］。Shivashankar 等［19］研究者對(duì)根尖周炎癥的患者進(jìn)行根尖周骨組織手術(shù)并將A-PRF 膜及羥基磷灰石應(yīng)用于術(shù)中骨缺損處,術(shù)后觀察治療效果穩(wěn)定,促進(jìn)新骨生成。Chandradas 等［20］也同樣應(yīng)用A-PRF 膜治療骨缺損時(shí)發(fā)現(xiàn)其改善了臨床及放射影學(xué)參數(shù)。A-PRF 膜亦可促進(jìn)上頜竇提升術(shù)竇底的骨組織愈合［21］。A-PRF 還常常應(yīng)用于因慢性牙周炎牙齒拔除術(shù)后的位點(diǎn)保存,從而減輕牙槽骨吸收量。改良后的A-PRF 膜可以更多的釋放生長因子促進(jìn)種植體周圍附著齦的生長,因此,無論是口腔種植、智齒拔除、外傷牙脫位,還是其他口腔頜面外科的有創(chuàng)創(chuàng)口,A-PRF 膜都能很好的促進(jìn)牙齦組織及骨組織的愈合,為患者縮短療程減輕術(shù)后反應(yīng)。

綜上所述,A-PRF 膜萃取液能夠很好的促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖,并且OPG 的含量也相應(yīng)有所增加,更加證實(shí)了A-PRF 膜在促進(jìn)牙齦組織愈合及骨組織愈合具有很好的貢獻(xiàn)。