PAX-1 甲基化應(yīng)用于HPV 陽性患者宮頸癌篩查的價值研究

馬媛 李穎 馬海蘭

宮頸癌是婦科的常見腫瘤,隨著人們生活模式的轉(zhuǎn)變,近年來宮頸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［1］。宮頸癌患者的死亡率較高,患者的死亡原因與腫瘤的轉(zhuǎn)移存在著密切的聯(lián)系,因此能夠早期對宮頸癌患者進行診斷、轉(zhuǎn)移的判斷能夠有效提高患者的預(yù)后［2,3］。1995 年,國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)專題討論會明確指出HPV 感染在宮頸癌的發(fā)生過程中起著十分重要的作用,但是關(guān)于其具體的致病機制仍然不明確［4］。已有較多研究證實編碼基因異常甲基化在胃癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織均明顯存在,同時與上述腫瘤的惡性生物學行為密切相關(guān),PAX-1 是另一種重要的抑癌基因,有研究顯示PAX-1 基因在宮頸癌患者中存在普遍的甲基化現(xiàn)象［5］。本研究通過分析HPV 陽性的宮頸癌患者的PAX-1 基因甲基化情況,旨在探索潛在的HPV 導致宮頸癌的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年6 月～2021 年6 月本院收治的120 例宮頸癌患者為研究對象,依據(jù)HPV 檢查結(jié)果分為陽性組(HPV 陽性)與陰性組(HPV 陰性),各60 例。另選擇同期收入本院的HPV 陽性而宮頸正常的患者60 例作為對照組。陽性組年齡43～83 歲,平均年齡(51.5±11.0)歲；陰性組年齡42～81 歲,平均年齡(52.0±11.5)歲；對照組年齡42～80 歲,平均年齡(53.0±11.2)歲。三組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本次研究均征得患者及其家屬的同意,并經(jīng)本院倫理委員會審批通過。

1.2 納入及排除標準 納入標準：①宮頸癌患者經(jīng)取材活檢病理檢查確診為宮頸癌；②選取患者均為首次就診,此前未進行過陰道抗菌藥物治療；③所有患者HPV 感染情況均由脫落細胞學檢查確定；④陽性組患者此前未采取任何治療。排除標準：①合并其他惡性腫瘤患者；②有其他能夠影響宮頸HPV 篩查的生殖系統(tǒng)疾病的患者。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取方法 將液氮罐中的標本放置于-80℃冰箱中；用錫紙將研缽包好置于200℃的高壓滅菌鍋中消毒；將10、200、1000 μl 的移液槍槍頭和1.5 ml 的離心管進行消毒備用；將組織自冰箱中取出,置于研缽中,將其敲碎30 mg 的組織,倒入液氮,進行研磨后移至EP 管中；后加入200 μl 的TL 緩沖液；加入25 μl OB 蛋白酶,充分混勻,在55℃溫度條件下水浴孵育,每隔30 min 震蕩1 次；離心(1000 r/min×5 min),取出不溶性組織沉淀,將上清液轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 ml EP 管中；加入220 μl BL 緩沖液,充分混勻。70℃孵育10 min；加入220 μl 無水乙醇,充分混勻；于2 ml 的收集管中組裝HiBand DNA 柱子,將得到的裂解物轉(zhuǎn)移到柱子中,置于離心機中進行離心(8000 r/min×2 min),棄去流下液體；將離心柱置于新的2 ml 收集管中,加入500 μl HB 緩沖液,離心(8000 r/min×2 min),棄去流下液體；將離心柱置于新的2 ml 收集管中,加入700 μl DNA 洗脫緩沖液,離心(8000 r/min×2 min),棄去流下液體,重復該步驟2 次；將離心柱放回2 ml的收集管中,離心(8000 r/min×2 min),從而使離心柱干燥；將離心柱置于無菌的1.5 ml EP 管中,加入100 μl 70℃的洗脫緩沖液,室溫下靜止3 min,離心(10000 r/min×1 min),洗脫DNA。將DNA 的洗脫液加入至離心柱中,離心(10000 r/min×1 min),于-20℃的冰箱中凍存。

1.3.2 基因甲基化檢測引物設(shè)計 利用Epidesigner軟件設(shè)計甲基化引物。檢測基因的CpG 島全序列,包括上下游添加序列。選擇軟件系統(tǒng)顯示設(shè)計的甲基化引物,在反向引物5’端添加31 個bp 大小T7 啟動子序列CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT,用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄；在正向引物5’端添加10 個bp 大小序列AGGAAGAGAG 以平衡聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。擴增產(chǎn)物長度為335～491 bp。亞硫酸氫鹽修飾基因組PCR 擴增。采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 擴增產(chǎn)物進行鑒定。

1.3.3 體外轉(zhuǎn)錄及堿基特異性酶切 充分混勻后封好,4℃離心(1000 r/min×1 min),PCR 儀設(shè)定程序如下：37℃,20 min →85℃,5 min → 4℃,forever。

1.3.4 芯片點樣及質(zhì)譜檢測 從384 孔板的裂解產(chǎn)物中抽取15 nl,加在SpectroCHlP 芯片上,于MassARRAY Compact System 上機檢測。用EpiTYPER 軟件分析MassARRAY 質(zhì)譜儀收集的質(zhì)譜圖,后進一步進行甲基化定量分析?；蚣谆栃月?基因甲基化陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組PAX-1 基因甲基化的表達陽性率比較陽性組中PAX-1 基因甲基化的表達陽性率為96.67%(58/60),陰性組中PAX-1 基因甲基化的表達陽性率為83.33%(50/60),對照組中PAX-1 基因甲基化的表達陽性率為11.67%(7/60)。陽性組中PAX-1 基因甲基化的表達陽性率高于陰性組與對照組,且陰性組高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.926、87.306,P=0.015、0.000<0.05)。

2.2 PAX-1 基因甲基化檢測結(jié)果與宮頸癌病理特征間的關(guān)系 PAX-1 基因甲基化檢測結(jié)果與宮頸癌患者年齡、腫瘤大小、組織分化程度、FIGO 分期無關(guān)(P>0.05)。PAX-1 基因甲基化檢測結(jié)果與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌患者PAX-1 基因甲基化檢測結(jié)果與宮頸癌病理特征的關(guān)系(n)

3 討論

宮頸癌在婦科疾病中十分常見,其發(fā)病率在女性群體中僅僅低于乳腺癌,而近年來宮頸癌的發(fā)生率還呈現(xiàn)出上升的趨勢,已經(jīng)對廣大女性群體的健康造成了十分嚴重的危害。宮頸癌的預(yù)后取決于其臨床分期、分化情況,同時宮頸癌的遠處轉(zhuǎn)移是造成患者預(yù)后不佳最重要的決定因素［6,7］。關(guān)于宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展的機制目前并不明確,多認為與基因、外界環(huán)境的共同作用有著密切的聯(lián)系。而在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中,轉(zhuǎn)移的發(fā)生是個較為漫長的過程,如果能在宮頸癌診斷早期即對其轉(zhuǎn)移情況、轉(zhuǎn)移傾向作出預(yù)測,這對于宮頸癌的治療、預(yù)后預(yù)測都具有十分重要的意義［8］。

作為最常見的婦科腫瘤,宮頸癌的發(fā)病原因一直倍受國內(nèi)外學者重視,1995 年,IARC 專題討論會明確指出HPV 感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因。目前關(guān)于HPV 致宮頸病變的機制還不十分清楚,但多數(shù)學者都認為HPV 導致宮頸發(fā)生病變的中心環(huán)節(jié)是HPV DNA與宮頸上皮細胞的整合。目前的研究顯示HPV DNA常常整合到第3 號和13 號染色體上,具體多定位于3p14 與13q14,而13q14 是抑癌基因Rb 基因的位點,當HPV 的DNA 整合到Rb 基因位點時有可能會使Rb基因失活從而導致癌癥的發(fā)生。也有研究指出除了整合到Rb 基因位點,HPV DNA 也能整合到PAX-1 的基因位點,PAX-1 基因是另一種抑癌基因,當HPV DNA整合到PAX-1 位點時能夠促進其正常表達量減少從而致癌［8］。

其中基因的甲基化是一種減少正常表達量的重要機制,在DNA 的復制和修復中,DNA 甲基化可以保持細胞原有的信息；DNMT3A 和DNMT3B 的主要功能是催化未發(fā)生甲基化的CpG 雙核苷酸從頭甲基化。富含CpG 位點的區(qū)域形成CpG 島,CpG 島存在于大量的重復序列中(如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和端粒DNA)和大約 60%基因的啟動子中［9］。重復序列中CpG 島的甲基化對于維持染色體穩(wěn)定性具有重要意義,絕大部分CpG 島的甲基化模式在正常生長發(fā)育過程中保持不變,但是存在部分CpG 島在發(fā)育過程中發(fā)生改變,例如生長發(fā)育中的基因組印記和X 染色體失活。目前對在不含CpG島的啟動子中的DNA 甲基化的認識水平還十分有限。研究顯示,腫瘤細胞中DNA 甲基化修飾存在明顯改變,表現(xiàn)為抑癌基因局部區(qū)域 CpG 島高甲基化造成其表達沉默,此外全基因組DNA 低甲基化造成染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低,逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、原癌基因的激活［10］。一項研究報道稱,通過對比分析正常組織和結(jié)腸癌組織的DNA 甲基化水平,結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織的DNA CpG 島的甲基化明顯上升［11］。

本研究分析HPV 陽性的宮頸癌患者的PAX-1 基因甲基化情況發(fā)現(xiàn),陽性組中PAX-1 基因甲基化的表達陽性率高于陰性組與對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PAX-1 基因甲基化檢測結(jié)果與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。

綜上所述,PAX-1 基因甲基化在宮頸癌組織中呈高表達狀態(tài),而在HPV 陽性宮頸癌中表達呈更高狀態(tài),通過對PAX-1 基因甲基化水平的檢測可以指導臨床診斷、治療宮頸癌。