MASP-1聯(lián)合血栓分子標(biāo)志物對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷價(jià)值

任曉慶 李琪 閆本純 馬思琦 李晨 李春燕 樊金宇 閆海潤(rùn)

彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）是感染性疾病危及生命的嚴(yán)重并發(fā)癥。據(jù)報(bào)道，膿毒癥患者合并DIC的發(fā)生率達(dá)30%～50%，并且其死亡率增加1倍[1]。典型的DIC診斷并不難，但診斷時(shí)往往已發(fā)展至中晚期，死亡率較高，故尋找能夠早期診斷膿毒癥合并DIC的新型標(biāo)志物至關(guān)重要。當(dāng)病原菌入侵機(jī)體，免疫系統(tǒng)激活、炎癥介質(zhì)和組織因子大量釋放，隨后引發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這被認(rèn)為是膿毒癥引發(fā)DIC的主要病理生理機(jī)制[2，3]。

補(bǔ)體系統(tǒng)是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。補(bǔ)體系統(tǒng)包括經(jīng)典途徑、旁路途經(jīng)和凝集素途徑，其中MASP-1是凝集素途徑的重要蛋白酶，凝集素途徑會(huì)識(shí)別病原體表面上的碳水化合物，導(dǎo)致MASP-1激活，隨后激活補(bǔ)體的共同途徑[4]。MASP-1是炎癥反應(yīng)中凝血系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)之間的重要交叉點(diǎn)，由于其具有類似凝血酶的活性，它能夠裂解纖維蛋白原和凝血因子ⅩⅢ[5]，從而激活凝血系統(tǒng)；隨后纖維蛋白的形成和凝血因子的釋放亦可激活補(bǔ)體系統(tǒng)，使補(bǔ)體蛋白MASP-1的表達(dá)增加，最終導(dǎo)致凝血和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活進(jìn)一步增強(qiáng)。膿毒癥DIC的發(fā)生發(fā)展主要?dú)w因于補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)的功能紊亂。因此，補(bǔ)體蛋白MASP-1在膿毒癥合并DIC中具有重要的調(diào)控作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，MASP-1與凝血系統(tǒng)之間的關(guān)系已得到證實(shí)[6，7]，然而，尚缺乏驗(yàn)證這一觀點(diǎn)的臨床研究。本研究探討MASP-1與膿毒癥患者凝血功能紊亂的關(guān)系，分析MASP-1與TAT、TM、t-PAIC三項(xiàng)血栓分子標(biāo)志物之間的相關(guān)性，評(píng)估其對(duì)膿毒癥合并DIC的早期診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取我院2019年10月～2021年8月收治的膿毒癥患者，參照膿毒癥3.0診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；排除年齡小于18歲、懷孕、重大創(chuàng)傷或手術(shù)、2周內(nèi)使用過抗凝藥物、惡性血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、惡性腫瘤等患者。本次研究符合收集標(biāo)準(zhǔn)的患者共106例，其中男58例，女48例，平均年齡（63.06±13.42）歲。按國(guó)際血栓與止血協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（ISTH）[9]，將患者分為DIC組（23例）和非DIC組（83例）。DIC組男14例，女9例，平均年齡（67.37±15.77）歲；高血壓10例，糖尿病4例，冠心病7例。非DIC組男44例，女39例，平均年齡（66.18±15.47）歲；高血壓29例，糖尿病11例，冠心病26例。以同期門診健康體檢者60例作為對(duì)照組，其中男34例，女26例，平均年齡（59.33±11.02）歲。三組之間年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且DIC組與非DIC組之間基礎(chǔ)疾病差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），均具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 連續(xù)收集被確診為膿毒癥患者的血漿，對(duì)患者臨床資料進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，將符合DIC診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者納入DIC組，否則納入非DIC組。用含0.3ml 3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑的采血管抽取患者及對(duì)照組的血液2.7ml，上機(jī)離心10min（3 000r/min），將上層血漿轉(zhuǎn)移至新的離心管中，30min內(nèi)于-80℃冰箱凍存。檢測(cè)前所有樣本1次室溫復(fù)溶后檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法 MASP-1的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法，儀器為Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀，試劑為MASP-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒。TAT、TM和t-PAlC的測(cè)定采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，儀器為HISCL-5000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀器，試劑為配套化學(xué)發(fā)光試劑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），以判斷各項(xiàng)標(biāo)志物的診斷性能。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血漿中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表達(dá)水平比較 DIC組患者血漿中MASP-1、TAT、TM和t-PAIC表達(dá)水平均高于非DIC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且兩組患者上述各指標(biāo)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 三組血漿中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表達(dá)水平比較（±s）

表1 三組血漿中MSAP-1、TAT、TM和t-PAIC表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與非DIC組相比，#P<0.05

組別 n MASP-1（μg/ml） TAT（ng/ml） TM（TU/ml） t-PAIC（ng/ml）對(duì)照組 60 12.9（9.13，15.3） 1.81（1.18，3.49） 8.54（7.41，10.04） 6.36（4.56，8.45）非DIC組 83 28.7（19.9，37.6）* 5.1（3.0，8.1）* 14.0（10.0，20.0）* 13.1（7.7，21.6）*DIC組 23 35.3（26.2，41.6）*# 11.6（3.6，25.0）*# 19.2（12.3，33.4）*# 21.1（13.7，32.8）*#

2.2 MASP-1與TM、TAT、t-PAIC的相關(guān)性 Spearman相關(guān)性分析顯示，膿毒癥患者M(jìn)ASP-1水平與TAT水平呈正相關(guān)（r=0.7447，P<0.001），與TM水平正相關(guān)（r=0.6362，P<0.001），與t-PAIC水平呈正相關(guān)（r=0.6241，P<0.001），見圖1。

圖1 MASP-1與TM、TAT、t-PAIC的相關(guān)性

2.3 MASP-1、TAT、TM和t-PAIC對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷效能 采用ROC曲線分析MASP-1、TAT、TM和t-PAIC對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷效能，曲線下面積分別為0.695、0.705、0.674、0.661；MASP-1和TAT、TM、t-PAIC聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積最大（0.751），敏感度為51.0%，特異性為87.6%，見表2、圖2。

圖2 各分子標(biāo)志物診斷膿毒癥合并DIC的ROC曲線

表2 各分子標(biāo)志物對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷價(jià)值

3 討論

膿毒癥發(fā)生時(shí)，由于病原菌入侵，機(jī)體固有免疫系統(tǒng)激活，導(dǎo)致凝血和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)增強(qiáng)，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生全身微血管血栓形成，進(jìn)而引起膿毒癥合并DIC。膿毒癥合并DIC的病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。凝集素途徑在先天性免疫中具有重要意義，并且補(bǔ)體蛋白MASP-1與凝血系統(tǒng)功能紊亂密切相關(guān)，可能是膿毒癥患者發(fā)生DIC的重要機(jī)制。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究顯示，MASP-1可裂解凝血酶原，其裂解方式與FXa介導(dǎo)的凝血酶原裂解相似，是凝血酶的另一種活化形式，可使TAT生成增加[10]；并且MASP-1具有切割和激活纖維蛋白原和因子ⅩⅢ的能力，可以驅(qū)動(dòng)交聯(lián)纖維蛋白原的形成并使其穩(wěn)定，加速血凝塊形成[11]。本研究在臨床研究中進(jìn)一步探討了膿毒癥患者M(jìn)ASP-1對(duì)凝血系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。ISTH評(píng)分是膿毒癥凝血功能障礙的公認(rèn)評(píng)分系統(tǒng)，但此評(píng)分系統(tǒng)有一定的局限性，因?yàn)檠“?、纖維蛋白原和纖維蛋白降解產(chǎn)物都是急性反應(yīng)物。為對(duì)凝血功能進(jìn)行全面了解，本研究進(jìn)一步測(cè)定了TAT血清水平。結(jié)果顯示，DIC組和非DIC組的TAT水平明顯高于對(duì)照組，說明膿毒癥患者普遍存在血液高凝狀態(tài)，凝血酶活性明顯高于對(duì)照組；DIC組明顯高于非DIC組，說明DIC患者血液高凝狀態(tài)更加嚴(yán)重。DIC組MASP-1表達(dá)水平明顯高于非DIC組，且兩組均高于對(duì)照組。Spearman相關(guān)性分析顯示，MASP-1與TAT呈正相關(guān)，TAT是凝血酶生成的分子標(biāo)志物，說明MASP-1的激活增加與膿毒癥的嚴(yán)重程度和凝血相關(guān)疾病密切相關(guān)，與Jenny等[5]研究中MASP-1可以增強(qiáng)微血管流動(dòng)模型中的血凝塊形成觀點(diǎn)一致。因此，MASP-1可作為膿毒癥相關(guān)凝血功能障礙發(fā)生和嚴(yán)重程度的潛在生物標(biāo)志物，其臨床實(shí)用性需進(jìn)一步驗(yàn)證。

膿毒癥時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞作為病原體及其毒素的靶細(xì)胞，易被過度活化的炎癥介質(zhì)損傷，同時(shí)抑制蛋白質(zhì)C的激活和抗凝血酶的釋放，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的凝血-抗凝系統(tǒng)失衡，增加了發(fā)生DIC的風(fēng)險(xiǎn)。TM和t-PAIC被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物，膿毒癥合并DIC患者血漿中TM和t-PAIC水平升高已被證實(shí)[12]。Debreczeni等[13]研究顯示，MASP-1可通過裂解蛋白酶激活的受體4激活內(nèi)皮細(xì)胞，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的TF表達(dá)、激活的內(nèi)皮細(xì)胞和血小板上P-選擇素的暴露增加及內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而增強(qiáng)內(nèi)皮損傷[14，15]。因此，MASP-1與膿毒癥合并DIC患者的內(nèi)皮損傷密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，DIC組TM、t-PAIC水平顯著高于非DIC組，并且Spearman相關(guān)性分析顯示，MASP-1與TM和t-PAIC水平分別呈正相關(guān)，TAT和t-PAIC作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物，說明MASP-1是膿毒癥患者發(fā)生DIC的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要病理因素。采用ROC曲線評(píng)估MASP-1、TAT、TM和t-PAIC對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷效能，結(jié)果顯示單獨(dú)指標(biāo)中TAT對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷性能最高（0.705），其次為MASP-1（0.695），t-PAIC的診斷效能最差（0.661）；MASP-1和TAT、TM、t-PAIC聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積最大（0.751），敏感度為51.0%，特異性為87.6%。說明膿毒癥患者的補(bǔ)體蛋白MASP-1與DIC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MASP-1作為膿毒癥相關(guān)DIC治療的生物標(biāo)志物或靶標(biāo)的潛力需在今后的研究中加以探討。后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，增加凝集素途徑其他蛋白的臨床研究以及更全方面的方法學(xué)來證實(shí)本研究觀點(diǎn)。

綜上所述，MASP-1與膿毒癥患者凝血功能紊亂和內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)，為探討膿毒癥患者合并DIC的發(fā)生機(jī)制提供了新思路。ROC曲線顯示MASP-1可作為膿毒癥患者合并DIC的早期新型標(biāo)志物，具有較理想的診斷價(jià)值；MASP-1聯(lián)合血栓分子標(biāo)志物對(duì)膿毒癥合并DIC的診斷價(jià)值更高，可為臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療及改善預(yù)后提供重要依據(jù)。