大白菜抗根腫病分子標(biāo)記研究進展

劉栓桃，王樹彬，王榮花，張志剛，李巧云，王立華，趙智中

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所／國家蔬菜改良中心山東分中心／山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點實驗室／農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學(xué)觀測實驗站（山東），山東 濟南 250100）

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染十字花科植株根部皮層細(xì)胞所引起的一種土傳病害［1］。蕓薹根腫菌是一類比較特殊的活體寄生的原生生物，在分類學(xué)上屬于原生生物界、根腫菌門、根腫菌綱［2］，幾乎可以侵染所有十字花科植物的根部［1，3－5］。根腫菌以休眠孢子狀態(tài)存活于土壤中，形態(tài)和大小不一［6］，一般在酸性土壤中易侵染寄主植物［3］。植株根部細(xì)胞受病菌侵染和刺激導(dǎo)致細(xì)胞大量分裂、增殖，最終使根部形成大小不一、形狀各異的腫瘤，因而稱為根腫病。發(fā)病嚴(yán)重時將影響植株根部水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和運輸，導(dǎo)致地上部輕則萎蔫、生長發(fā)育緩慢，重則失綠乃至死亡［1，7］，最終導(dǎo)致減產(chǎn)或絕產(chǎn)。該病害于18世紀(jì)在英格蘭被廣泛報道［3］，20世紀(jì)20～30年代在全球多地被發(fā)現(xiàn)［8－10］，日本于1892年［11］、韓國于1920年［1］相繼發(fā)現(xiàn)，我國有文獻記載的根腫病危害的報道始見于1956年［12］。目前根腫病已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)危害十字花科作物最重要的土傳病害［1，13］，隨著人口和物質(zhì)的全球化流動、農(nóng)業(yè)機械化程度的不斷提高以及農(nóng)業(yè)機械跨區(qū)域作業(yè)的實施，根腫病的蔓延速度加劇，嚴(yán)重威脅十字花科蔬菜產(chǎn)業(yè)的安全生產(chǎn)。本文就大白菜（Brassica rapa L.ssp pekinensis）抗根腫病基因的遺傳定位及分子標(biāo)記開發(fā)研究進展做簡要概述。

1 根腫菌抗源的篩選

大白菜是十字花科主要的蔬菜作物，在亞洲乃至全球都有種植。我國是大白菜起源地，雖然種質(zhì)資源豐富，但根腫病的抗源材料十分稀缺。趙俊等［14］發(fā)現(xiàn)山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所早年培育的直筒類型品種“晉菜三號”和“太原二青”在昆明市盤龍區(qū)表現(xiàn)抗病，關(guān)于這兩個品種的抗性轉(zhuǎn)育報道較少。

目前大白菜根腫病抗源多來自歐洲蕪菁（B.rapa L.ssp rapifera），這與歐洲各國農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展較早有直接關(guān)系。蕪菁作為養(yǎng)殖業(yè)重要飼料在歐洲大面積種植，20世紀(jì)20～30年代，隨著機械化采收設(shè)備在一些大型農(nóng)場的推廣使用，導(dǎo)致根腫病大面積爆發(fā)，迫使農(nóng)場主和政府重視抗病品種的選擇。如在荷蘭，個別農(nóng)民自發(fā)選育了一些抗病品種，關(guān)于抗根腫病蕪菁資源的篩選工作也率先得到開展［15－18］?！癑obe cut－leaves”是20世紀(jì)30年代由荷蘭農(nóng)場主自發(fā)選育的抗病品系并迅速得到推廣，20世紀(jì)40年代抗性出現(xiàn)下降［16，17］。第二次世界大戰(zhàn)以后至20世紀(jì)60年代中期，是抗病品種自主選育階段，這一時期荷蘭育種者選育了一批抗根腫病品種如“Barenza”“Mommersteeg’s cut－leaved”“Mommersteeg’s full－leaved”“Civasto－R”“Novitas”“Nobitter－R”“Gelria－R”“Civasto－h(huán)eelblad－R”“Jobe－Heelblad”“Meetjeslander”“Waaslander”等［16，17］。

大白菜的抗性轉(zhuǎn)育工作率先在日本開展［1，11，19，20］，因為大白菜在日本有比較悠久的栽培歷史和較大的種植面積，二戰(zhàn)后伴隨著日本經(jīng)濟的迅速復(fù)蘇，根腫病在日本開始爆發(fā)。20世紀(jì)60～70年代日本從歐洲引進了抗病蕪菁并開始了抗性的回交轉(zhuǎn)育工作，所用抗源主要是飼用蕪菁Gelria R、Siloga、Debra、Milan White以及ECD鑒別寄主ECD1～4［4，11，19，21－23］。至20世紀(jì)末，日本已先后選育出50多個抗根腫病大白菜雜交種，如“CR Kanko”“CR Kukai 65”“CR Ryutoku”“CR Utage 70”“CR W－1116”等［19，23］。

近年來隨著農(nóng)業(yè)機械跨區(qū)域作業(yè)的廣泛實施，根腫病在中國各地開始流行，其危害有逐年加重的趨勢?？垢[病大白菜品種多數(shù)從日本與韓國引進，近年來也有了自主選育的抗根腫病大白菜雜交種，如山東德高種業(yè)有限公司選育的“德高CR117”、北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心選育的“CR京秋新3號”，其中“CR京秋新3號”的抗源來自大白菜雜交種“CR為民”［24］。

綜上所述，大白菜中抗源主要來自歐洲蕪菁，新選育的抗根腫病大白菜品種在某地種植數(shù)年后，由于土壤中根腫菌種群的變化或根腫菌本身的遺傳變異，導(dǎo)致品種抗性逐漸下降，但原始蕪菁抗源仍然保持較高抗性，原因可能為在回交轉(zhuǎn)育過程中部分抗性基因丟失［17，19，23］。因此有必要對抗性基因進行全面的遺傳定位，開發(fā)緊密連鎖的分子標(biāo)記或直接開發(fā)功能性分子標(biāo)記，為利用分子標(biāo)記輔助選擇聚合多個抗性基因、選育持久抗根腫病大白菜新材料奠定基礎(chǔ)。

2 大白菜抗根腫病QTL定位及分子標(biāo)記開發(fā)研究進展

大白菜對根腫病的抗性由多基因控制，遵循主基因＋微效多基因的遺傳模式［4，22，23］，迄今為止已經(jīng)先后定位到23個抗根腫病位點，開發(fā)的標(biāo)記有60多個［5，25］，這些位點和標(biāo)記主要集中在基因組的少數(shù)幾個區(qū)域。

2.1 以Crr3為代表的A03－1抗性位點群及相關(guān)檢測標(biāo)記

在A03染色體上臂有5個抗性位點，分別是Crr3、CRk／CRky、CRd、BrA.CR.c、PbBa3.3［26－31］，總計報道12個標(biāo)記，根據(jù)各標(biāo)記序列在BRAD（V3.0）數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)標(biāo)記的位置介于15.04 ～16.33 Mb之間，相關(guān)抗性位點以及連鎖標(biāo)記信息詳見表1。

表1 A03－1抗性位點群

Crr3首先由Hirai等［26］于2004年報道，兩個邊界之間的標(biāo)記分別是OPC11－1S和OPC11－2S，介于基因組A03染色體15 037 679～16 177 745 bp之間。Saito等［27］于2006年對其進行了精細(xì)定位，開發(fā)了4個緊密連鎖標(biāo)記，分別是BrSTS－41、BrSTS－44、BrSTS－54和BrSTS－61，介于16 099 017～16 330 781 bp之間。Sakamoto等［28］在鄰近的區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個新位點，命名為CRk，指出與Crr3連鎖的標(biāo)記OPC11－2S與CRk連鎖，但沒有開發(fā)出新的標(biāo)記。Chen等［29］于2013年發(fā)現(xiàn)了一個抗性QTL位點PbBa3.3，發(fā)現(xiàn)與Crr3緊密連鎖的標(biāo)記BrSTS－61與該位點連鎖，但沒有開發(fā)相應(yīng)標(biāo)記。Pang等［30］于2018年發(fā)現(xiàn)抗性位點CRd，兩個SNP標(biāo)記yau389和yau376分別位于CRd的左、右邊界，相距60 kb；同時發(fā)現(xiàn)與Crr3連鎖的標(biāo)記BrSTS－61在所用的抗／感材料之間有多態(tài)性，并且推測CRd位于Crr3的上游。雖然Pang等沒有給出標(biāo)記的物理位置，但根據(jù)作者提供的4個候選基因（Bra001160、Bra001161、Bra001162和Bra001175）的物理位置，推測CRd介于15 977 460～16 089 616 bp之間。BrA.CR.c是最近發(fā)現(xiàn)的一個抗性QTL位點［31］，3個共顯性標(biāo)記SS15FR1、SS15FR3、SS15FR5均與其連鎖，介于15 957 475～15 992 186 bp之間。由此可見，上述5個位點的標(biāo)記在A03染色體15 037 679～16 330 781 bp之間，相距約1 300 kb，從物理位置看它們位于A03染色體上游，因此稱為A03－1抗性位點群。

2021年，Kopec等［32］在油菜中克隆了抗性基因Crr3Tsc，該基因?qū)?yīng)油菜A基因組的功能基因BnaA03g29300D，在大白菜參考基因組中對應(yīng)A03染色體上的Bra001175（15 145 899～15 152 027 bp）。

2.2 以CRa／CRb為代表的A03－2抗性位點群及相關(guān)檢測標(biāo)記

在A03染色體下臂，有9個抗性位點分別是CRa、CRb、CRbki、BraA3P5X／G.CRa／bKato1.1、BraA3P5X／G.CRa／bKato1.2、Rcr1、Rcr2、Rcr4和BrA.CR.a［22，33－43］，根據(jù)報道的連鎖標(biāo)記的物理距離，主要集中在A03染色體23.72～26.52 Mb，稱其為A03－2抗性位點群，先后報道的連鎖標(biāo)記有30多個（表2）。

表2 A03－2抗性位點群

CRa來源于ECD2，最早由Matsumoto等［22］于1998年報道，并開發(fā)了與抗性位點CRa連鎖的RFLP標(biāo)記HC352b和HC181，位于第三連鎖群。由于該標(biāo)記沒有序列信息，因此無法定位CRa的物理位置。Matsumoto等［33］于2005年進一步用6個分離群體驗證RFLP標(biāo)記效果，發(fā)現(xiàn)兩個RFLP標(biāo)記都位于CRa位點的同一側(cè)，同時在CRa位點另一側(cè)開發(fā)了一個RAPD 標(biāo)記E49380，距離CRa約4.6 cM，由于該RAPD標(biāo)記序列太短，在BRAD數(shù)據(jù)庫中沒有比對到具體位置信息。Hayashida等［34］將RFLP標(biāo)記HC352b成功轉(zhuǎn)化成了比較方便檢測的SCAR 標(biāo)記，即HC352b－SCAR，該標(biāo)記與CRa緊密連鎖，介于24 740 847～247 40 998 bp之間。Matsumoto等［35］用一個與CRa緊密連鎖的SCAR 標(biāo)記SC2930進行標(biāo)記輔助選擇聚合育種，取得很好的效果，該標(biāo)記正向引物是兩個位點特異引物，在抗／感材料之間序列不同，標(biāo)記介于25 990 052～25 990 865 bp之間。

CRb最早由Piao等［36］于2004年報道，將5個連鎖的AFLP標(biāo)記均轉(zhuǎn)化成了SCAR標(biāo)記和CAPS標(biāo) 記，分 別 是 TCR02、TCR05、TCR08、TCR09、TCR10；根據(jù)標(biāo)記序列比對結(jié)果，CRb介于A03染色體21 186 392 ～26 841 725 bp之間。Kato等［37］用抗根腫病大白菜雜交種Akiriso和CR Shinki構(gòu)建F2群體，定位到一個與CRb緊密連鎖的位點 CRbki，兩側(cè)標(biāo)記分別是KBrH059N21F、KBrH129J18R，距離CRb分別為0.3 cM和0.4 cM，在25 372 383～25 968 035 bp之間。隨后Kato等［38］對CRb進行了精細(xì)定位，進一步開發(fā)了兩個緊密連鎖標(biāo)記KB59N07和B1005，介于25 372 516～25 551 199 bp之間。Fredua－Agyeman等［39］以ECD2為母本與兩個感病親本CR2599和CR1505分別配制了兩個F2群體（pop1以CR2599為父本，pop2以CR1505為父本），用3個根腫菌生理小種（3H、5X、5G）接種鑒定并采用分群分析法（BSA）進行抗根腫病QTL定位，結(jié)果定位到兩個抗性位點BraA3P5X／G.CRa／bKato1.1和BraA3P5X／G.CRa／bKato1.2，前者介于25 274 417～25 522 227 bp（KB69N05和B4732），后者介于25 601 419～25 860 581 bp（BGA06和KB29N19）。

綜上，CRa、CRb所在的染色體區(qū)域為21 186 392～25 990 865 bp之間，在此區(qū)域內(nèi)Hatakeyama等［40］圖位克隆了CRb，序列分析發(fā)現(xiàn)其與Ueno等［41］鑒定的CRa是同一個基因，對應(yīng)于參考基因組Bra019410、Bra019412和Bra019413三個基因的位置。另外，其他研究者用不同抗源材料和病原物在此區(qū)域內(nèi)或附近又發(fā)現(xiàn)了幾個抗病位點，如Rcr1［42，44］、Rcr2［43］、Rcr4［45］以及BrA.CR.a［31］，前3個都是SNP標(biāo)記，與BrA.CR.a連鎖的是4個SSR 標(biāo)記，綜合4 個位點的物理位置，BrA.CR.a介于25 203 402～25 636 146 bp之間，正好落在CRa和CRb的目標(biāo)區(qū)間內(nèi)，稱為A03－2抗性位點群。

2.3 以Crr1為代表的A08抗性位點群及相關(guān)檢測標(biāo)記

在A08染色體上臂10～13 Mb之間，報道了6個抗性位點，分別是Crr1／Crr1a、Crr1／Crr1b、Rcr3、Rcr9、BrA.CR.b以及PbBa8.1［4，29，31，46－49］，有15個緊密連鎖標(biāo)記（表3）。

表3 A08抗性位點群

Crr1最早由Suwabe等［4］報道，發(fā)現(xiàn)與之連鎖的SSR 標(biāo)記BRMS－088，位于13 205 338～13 205 570 bp；隨后又開發(fā)了3個更加緊密連鎖的標(biāo)記BSA1、BSA2、BSA7［46］，將目標(biāo)位點鎖定在11 581 315～12 228 818 bp，對Crr1進行精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)，該位點包含兩個基因，即Crr1a和Crr1b。Hatakeyama等［48］對Crr1a進行了圖位克隆，發(fā)現(xiàn)來自抗性材料的基因Crr1aG004編碼一個TIRNB－LRR蛋白，而感病材料的基因Crr1aA9709則編碼一個殘缺的NB－LRR蛋白，即感病材料中缺失了TIR結(jié)構(gòu)域中的大部分序列。在大白菜參考基因組中，與Crr1a同源性最高的基因是Bra020861（12 271 594～12 287 495 bp）。

Hirani等［31］在A08染色體發(fā)現(xiàn)一個抗性QTL位點BrA.CR.b，有5個SSR標(biāo)記與之連鎖，分別是S14R14、S11R11、S08R08、S07R07、S06R06，介 于11 961 933～12 433 896 bp，該位點包括Crr1。Chen等［29］在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個抗性位點PbBa8.1，連鎖分析發(fā)現(xiàn)該位點就是Crr1。緊鄰Crr1還有兩個位點即Rcr3和Rcr9，其中Rcr3定位于SNP標(biāo)記A90＿A08＿SNP＿M12和A90＿A08＿SNP＿M16之間，Rcr9位于A90＿A08＿SNP＿M28和A90＿A08＿SNP＿M79之間，前者在10.00～10.23 Mb之間，后者在10.85～11.17 Mb之間［49］，這兩個位點可能與Crr1不同，由于都位于A08染色體上，與最早鑒定的Crr1位點毗鄰，因此稱為A08抗性位點群。

2.4 其它抗性位點及相關(guān)檢測標(biāo)記

除上述3個比較集中的抗性位點群外，在A01、A02和A06染色體上也發(fā)現(xiàn)了少數(shù)抗性位點。如位于A01的Crr2最早由Suwabe等［4］發(fā)現(xiàn)，與之連鎖的有4個標(biāo)記，即BSA3、BSA4、BSA5、BRMS－096，介于染色體5 589 394～6 352 275 bp之間［4，45］，Chen等［29］報道的抗性位點PbBa1.1就是Crr2。在A02上有一個抗性位點CRc［28，35］，與之連鎖的抗性標(biāo)記是B50、感病標(biāo)記是m6R，抗性標(biāo)記在24 Mb，感病標(biāo)記提供的引物序列特異性不好，難以判斷其在基因組中的位置。A06上有一個抗性位點Crr4［4］，標(biāo)記BSA6、BSA8和BSA9的正向引物特異性均不是較好，反向引物的位置范圍跨度較大，介于10 572 479～20 638 046 bp之間，以上抗性位點均沒有克隆過相關(guān)的功能基因。

3 抗病功能基因的特點

目前，A基因組中對應(yīng)的3個抗性位點群即A03－1、A03－2以及A08均已經(jīng)有功能基因被克隆和鑒定［32，40，47］，根據(jù)相關(guān)文獻報道，主要有以下特點。

3.1 開發(fā)標(biāo)記的引物序列在抗／感材料之間高度保守

從已經(jīng)克隆的3個位點的功能基因序列在抗／感材料之間的比對結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，所用檢測標(biāo)記的引物序列在抗／感基因之間恰好處于保守區(qū)域［32，40］，這表明開發(fā)的緊密連鎖標(biāo)記（表1、2、3）仍然可以繼續(xù)用于抗性位點的檢測和標(biāo)記輔助選擇。

3.2 抗性基因在參考基因組中都有對應(yīng)的基因

雖然大白菜參考基因組序列的提供者“Chiifu－401－42”不抗根腫?。?0］，但是所克隆的抗性基因在參考基因組中都有對應(yīng)的功能基因，只不過在參考基因組中對應(yīng)的基因序列與抗性基因之間存在一些差異。如在抗性油菜材料“Tosca”中，位于A基因組上包含Crr3Tosca基因在內(nèi)的約7 kb的區(qū)域發(fā)生了局部的基因組重復(fù)，因此抗性材料“Tosca”中存在兩個拷貝的抗性基因T1和T2［32］，而Crr3Tosca對應(yīng)大白菜參考基因組（V1.5）編碼基因Bra001175，經(jīng)過序列比對發(fā)現(xiàn)T1－cDNA和T2－cDNA與Bra001175的編碼區(qū)分別有80.08%和77.23%的相似性，兩者之間都有多處插入／缺失和較多SNP差異?？剐源蟀撞瞬牧稀?074RR”中，CRb位點所在的區(qū)域有6個串聯(lián)重復(fù)的TIR－NB－LRR編碼基因，分別是CRb＿α、CRb＿β、CRb＿γ、CRb＿δ、CRb＿ε和Bra019410＿R，而在“Chiifu－401－42”中，有3個預(yù)測的編碼基因即Bra019410、Bra019412、Bra019413，其序列與上述6個來自抗性材料的ORF有超過80%的同源性［40］。另一個抗性基因Crr1aG004的mRNA序列（AB605024）［46］與 大 白 菜 參 考 基 因 組 的Bra020861（V1.5）的編碼區(qū)有53.2%的相似性，二者主要區(qū)別在于Crr1aG004在5′端有一處較大片段的缺失，同時還有較多SNP差異。

由此可見，已經(jīng)克隆的3個功能基因在參考基因組中都有對應(yīng)的編碼基因，且都屬于TNL家族，因此可以依據(jù)抗性位點目標(biāo)區(qū)域兩側(cè)緊密連鎖標(biāo)記之間編碼基因的注釋信息，篩選潛在的候選基因。

4 抗病位點候選基因篩選

已經(jīng)克隆的抗病基因都屬于TNL家族，據(jù)此對所有抗病位點目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的編碼基因進行了關(guān)鍵詞篩選，選擇Pfam＿annotation和Swissprot＿annotation有disease resistant、或有TIR、NB、LRR等結(jié)構(gòu)域的基因，詳見表4。除了已經(jīng)證明的CRa和CRb［40］是相同的功能基因外，并沒有直接的證據(jù)表明在同一個抗性位點群的其它幾個抗性位點都是相同的功能基因，即使Crr1也包含兩個不同的基因Crr1a和Crr1b［46］。因此在3個抗性位點比較集中的區(qū)域（A03－1、A03－2、A08），表4列出了其它候選基因以供參考。位于A02的Rcr8［48］和A06的Crr4［45］的定位區(qū)間或者沒有注釋信息如上所述基因，或者由于定位區(qū)間比較寬泛，具有上述注釋信息的功能基因比較多，這兩個位點的候選基因有待進一步精細(xì)定位以后再預(yù)測。

表4 抗性位點目標(biāo)區(qū)間內(nèi)抗性基因預(yù)測

5 總結(jié)與展望

一個抗病品種在某地推廣種植數(shù)年后，由于田間根腫菌種群的變化或者根腫菌本身的遺傳變異常常出現(xiàn)品種抗性下降的問題［17，19，23］。有些蕪菁抗源材料即使經(jīng)過多年種植仍然保持較高抗性，推測在利用蕪菁進行大白菜抗性材料的回交轉(zhuǎn)育過程中，有可能丟掉了部分抗性基因［19，23］，這給利用蕪菁抗源轉(zhuǎn)育大白菜抗性材料提出了新的難題。一方面，建議根腫病高發(fā)區(qū)選取不同的抗病品種輪流種植，避免因單一品種連續(xù)種植造成根腫菌優(yōu)勢種群的改變；另一方面，通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法將已經(jīng)明確的抗性基因聚合在一個品種中，培育廣譜抗根腫病品種。

由于根腫病抗性位點較多，即使采用標(biāo)記輔助選擇的手段，對已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的23個抗性位點而言，聚合育種并非容易實現(xiàn)。由于基因編輯技術(shù)可以精準(zhǔn)地對生物體基因組特定目標(biāo)基因進行修飾，因此，未來抗根腫病育種應(yīng)適當(dāng)關(guān)注根腫菌侵染大白菜的分子機制，鑒別更多的寄主關(guān)鍵因子，可利用基因編輯技術(shù)將寄主因子進行定點突變，使病菌無法入侵?；蚓庉嫾夹g(shù)的實施需要創(chuàng)建不受基因型限制的大白菜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，以便為利用基因編輯技術(shù)直接在基因組層面阻斷病菌侵染，為培育持久抗根腫菌大白菜新種質(zhì)提供技術(shù)儲備。