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    花椒黃酮提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性的研究

    2022-07-09 04:01:12王和濤劉羅羅
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:花椒羥基清除率

    王和濤,劉羅羅

    (1.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部,山東 青島 266100;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 泰安 271018)

    花椒(Zanthoxylum bungeanum)是重要的香料和藥用經(jīng)濟(jì)作物,為蕓香科花椒屬落葉小喬木[1,2],在我國分布廣泛,大多在海拔1 200 m以下山坡,主要產(chǎn)于貴州、云南、四川等省份[3-5]。目前已形成四川茂漢、貴州六盤水、云南曲靖等全國聞名的種植基地[6,7]?;ń烦蟹枷阌汀⒍喾?、糖苷、生物堿、蛋白質(zhì)等多種活性成分外,還富含黃酮類化合物[8,9]。黃酮類化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、防止動(dòng)脈硬化、延緩衰老等藥理活性[10-12],已被廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域[13,14]。對(duì)花椒中黃酮進(jìn)行提取并開發(fā)成多種類型的功能食品及其他高附加值產(chǎn)品,有助于實(shí)現(xiàn)花椒資源的高值化利用[15,16]。

    超聲波輔助提取法主要是利用其空化作用破壞植物細(xì)胞使提取物溶入提取液中,進(jìn)而提高提取效率,是一種操作簡單、便捷、能耗低的生物活性物質(zhì)提取方法[17]。目前,關(guān)于黃酮提取工藝優(yōu)化的研究報(bào)道較多:如楊爽等[18]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化索氏提取薏米中黃酮;馬俊鵬等[19]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選鐵力木花蕾總黃酮提取工藝;米智等[20]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化苦蕎黃酮提取工藝。然而,利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取技術(shù)提高花椒中黃酮提取得率的研究還鮮見報(bào)道。因此,本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取花椒中的黃酮,以乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間為考察因素,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化其最佳提取工藝,并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步評(píng)價(jià),旨在為花椒黃酮的高值化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與試劑

    花椒:市售,產(chǎn)地云南曲靖市,用研磨儀粉碎過80目篩后備用。

    水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定一級(jí)水;硝酸鋁、乙酸鉀、氫氧化鈉等(均為分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇(分析純):濟(jì)南潤泰化工有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%,生產(chǎn)批號(hào):C100001):北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、維生素C(純度≥98.0%):北京壇墨質(zhì)檢有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    CLN-24L低溫組織研磨儀:上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;FA2204電子分析天平:上海衡平儀器儀表有限公司;UV-2601可見分光光度計(jì):北京北分瑞利分析儀器(集團(tuán))公司;80目標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)篩:上海過望化工有限公司;SCQ-1800F超聲波提取儀:上海聲彥超聲波儀器有限公司;H2500R-2高速冷凍離心機(jī):湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;WB-502S超級(jí)電熱恒溫水浴鍋:廣東環(huán)凱生物科技有限公司;OE-45電熱鼓風(fēng)干燥箱:中科瑞捷(天津)科技有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 花椒黃酮的提取 稱取適量花椒粉末置于圓底燒瓶中,加入適量石油醚(60~90℃),回流萃取3次,旋轉(zhuǎn)濃縮除去石油醚,殘?jiān)?0℃烘箱中干燥至恒重取出,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    稱取上述殘?jiān)鼧悠?.0 g(精確至0.001 g)置于150 mL具塞三角瓶中,用75% ~95%的乙醇作為提取溶劑,按料液比1∶(10~30)g/mL加入提取溶劑,在提取溫度為40~80℃條件下置于超聲波提取儀中提取15~55 min,儀器工作頻率為40 kHz;提取液以4 500 r/min離心10 min,取上清液;按照相同條件重復(fù)1次,合并提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸餾儀濃縮至1 mL,過C18SPE小柱進(jìn)行脫色處理,用無水乙醇定容至50 mL,得到花椒黃酮的提取液,待測。

    1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取50 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中,加無水乙醇定容至刻度,并超聲溶解,即得濃度為1.0 mg/mL貯備液,于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩>芪√J丁貯備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL,分別置于50 mL容量瓶中,加無水乙醇至總體積為15 mL,然后依次加入質(zhì)量濃度為100 g/L的硝酸鋁溶液1 mL、98 g/L的乙酸鉀溶液1 mL,搖勻后加水至刻度,再次搖勻,靜置60 min,即得標(biāo)準(zhǔn)工作液,其質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL;用1 cm比色皿于420 nm處測其吸光度,以30%乙醇溶液為空白;以50 mL中蘆丁質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得y=1.7879x+0.06984,R2=0.9999。

    1.3.3 花椒黃酮的測定 精密吸取待測樣品溶液1.0 mL,置于50 mL容量瓶中,按照1.3.2顯色反應(yīng)后測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算花椒黃酮提取得率:

    式中:X為黃酮類化合物的得率,%;m為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的樣品比色液中蘆丁質(zhì)量,mg;W 為樣品的質(zhì)量,g;d為稀釋比例。

    1.3.4 單因素試驗(yàn) 固定料液比1∶20 g/mL、提取溫度70℃、時(shí)間35 min,考察不同乙醇濃度(75%、80%、85%、90%、95%)對(duì)花椒黃酮得率的影響;固定乙醇濃度85%、提取溫度70℃、提取時(shí)間35 min,考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對(duì)花椒黃酮得率的影響;固定乙醇濃度85%、料液比1∶20 g/mL、提取時(shí)間35 min,考察不同提取溫度(40、50、60、70、80℃)對(duì)花椒黃酮得率的影響;固定乙醇濃度85%、料液比1∶20 g/mL、提取溫度70℃,考察不同提取時(shí)間(15、25、35、45、55 min)對(duì)花椒黃酮得率的影響。

    1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時(shí)間(D)為自變量,以花椒黃酮得率(Y)為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理[25]做四因素三水平曲面設(shè)計(jì),應(yīng)用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及模型建立,對(duì)黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素、水平見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

    1.3.6 花椒黃酮體外抗氧化活性研究 DPPH自由基清除試驗(yàn):根據(jù)已報(bào)道的方法[21,22],用95%乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液,分別在10支10 mL離心管中加入1.0 mL不同濃度的樣品提取液,再分別加入DPPH溶液4 mL,充分搖勻,于黑暗環(huán)境中反應(yīng)30 min,在517 nm處測定其吸光度。以相同質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸(VC)作為陽性對(duì)照,用以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率:

    式中:SDPPH為DPPH自由基清除率,%;A0為1 mL蒸餾水+4 mL DPPH溶液的吸光度;Ai為1 mL樣品+4 mL DPPH溶液的吸光度;Aj為1 mL樣品+4 mL無水乙醇的吸光度。

    花椒黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力:根據(jù)文獻(xiàn)方法[23,24],分別在10支10 mL離心管中分別加入1.0 mL不同濃度的樣品提取液,再分別依次加入6 mmol/L的FeSO42.0 mL和6 mmol/L的水楊酸2.0 mL,混勻后再加入6 mmol/L的H2O22.0 mL啟動(dòng)Fetion反應(yīng),35~40℃恒溫水浴35 min,靜置15 min后于510 nm處測定其吸光度。以相同質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸(VC)作為陽性對(duì)照,用以下公式計(jì)算羥基自由基清除率:

    式中:S羥為羥基自由基清除率,%;Ae為空白組吸光度;Ax為樣品組吸光度;As為去離子水代替H2O2測得的對(duì)照組吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    每組試驗(yàn)平行測定3次,使用Microsoft office 2016制圖,應(yīng)用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 花椒總黃酮提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

    由圖1結(jié)合表2分析可知,花椒黃酮提取得率隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢,當(dāng)乙醇濃度為85%時(shí)達(dá)到最大值。原因可能是乙醇濃度為85%時(shí),花椒黃酮的溶出趨于飽和;隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加,花椒中其他脂溶性物質(zhì)、醇溶性色素溶出增多,這些成分會(huì)與花椒黃酮類化合物競爭乙醇-水分子結(jié)合體,從而使得花椒黃酮得率降低。因此選擇80%、85%、90%乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

    表2 黃酮提取工藝因素水平

    圖1 單因素對(duì)黃酮得率的影響

    料液比1∶(10~20)g/mL范圍內(nèi),隨著乙醇比例增加花椒黃酮提取得率急劇增加。其原因可能是隨著乙醇比例的增大,花椒樣品與提取溶劑的接觸面積增大,這有利于花椒黃酮的溶出;隨著乙醇比例繼續(xù)增加,花椒黃酮提取得率趨于平緩,不僅會(huì)造成其他雜質(zhì)溶出,還會(huì)增加提取成本。因此選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25 g/mL進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

    花椒黃酮的提取得率隨著提取溫度的升高呈先增大后降低的趨勢,70℃時(shí)達(dá)到最大值。其原因可能是在一定的范圍內(nèi)提高提取溫度能降低提取溶劑與樣品的粘稠度,增加花椒黃酮在提取溶劑中的擴(kuò)散性和溶解度,有利于花椒黃酮溶出從而使提取得率升高。當(dāng)提取溫度過高時(shí),高溫會(huì)造成花椒黃酮的破壞,從而使其提取得率降低。因此選擇提取溫度60、70、80℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

    花椒黃酮提取得率隨著提取時(shí)間的延長呈先增加后降低趨勢,并在35 min時(shí)達(dá)到最大值。這表明提取時(shí)間為35 min時(shí),花椒黃酮已趨于完全溶入提取溶劑中,繼續(xù)延長提取時(shí)間反而會(huì)使花椒黃酮長時(shí)間處于高溫浸泡中,導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)破壞,同時(shí)伴隨花椒中其他雜質(zhì)的溶出,花椒黃酮提取得率下降。因此選擇提取時(shí)間25、35、45 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

    2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

    2.2.1 回歸模型的建立及分析 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用響應(yīng)面法對(duì)花椒黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見表3。對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得回歸方程為Y=56.18+0.37A-0.21B-0.74C+0.59D+0.64AB-0.51AC+0.47AD+0.57BC-0.78BD+0.37CD-0.69A2+1.01B2-0.88C2+1.87D2。

    表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

    由表4可知,P模型<0.0001,表明回歸模型具有高度顯著性;P失擬項(xiàng)=0.836>0.05,說明模型構(gòu)建成功,試驗(yàn)以外的其他因素對(duì)黃酮提取得率影響較小;判定系數(shù)R2=0.987,表明回歸方程的擬合度較好。根據(jù)F值的大小可知,4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)黃酮得率的影響表現(xiàn)為提取溫度(C)>乙醇濃度(A)>提取時(shí)間(D)>料液比(B)。其中,一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)D2對(duì)黃酮得率的影響極顯著(P<0.01),一次項(xiàng)D和二次項(xiàng)A2及交互項(xiàng)AB、AC對(duì)黃酮得率的影響顯著(P<0.05),其余項(xiàng)影響不顯著。

    表4 回歸模型的方差分析

    2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 為評(píng)價(jià)兩因素交互作用對(duì)黃酮得率的影響并確定各因素的最佳水平范圍,分別繪制4因素兩兩交互的響應(yīng)曲面圖,如圖2所示。曲面走勢越陡峭,表明兩因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著[25]??梢钥闯?,乙醇濃度與料液比、乙醇濃度與提取溫度的交互作用顯著,表現(xiàn)為響應(yīng)曲面走勢陡峭。

    圖2 兩兩因素交互作用對(duì)花椒黃酮得率的影響

    2.3 最佳提取工藝的確定與驗(yàn)證

    應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件求解二次回歸方程可得花椒黃酮提取最優(yōu)工藝參數(shù):乙醇濃度為85.24%,料液比為1∶19.89 g/mL,提取溫度為71.12℃,提取時(shí)間為35.15 min,預(yù)測花椒黃酮的提取得率為11.98%??紤]到實(shí)際提取工作中的操作可行性,將工藝參數(shù)修正為:乙醇濃度85%,料液比1∶20 g/mL,提取溫度70℃,提取時(shí)間35 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),花椒黃酮的實(shí)際提取得率為12.16%,該值與預(yù)測值基本相符,表明確定的黃酮提取工藝準(zhǔn)確有效。

    2.4 抗氧化活性分析

    2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH是一種以氮為中心非常穩(wěn)定的自由基,在517 nm處具有較強(qiáng)的吸光度,通常用于檢測樣品的抗氧化能力。由圖3可知,花椒黃酮質(zhì)量濃度在0.01~1.0 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加呈上升趨勢。0.2 mg/mL時(shí),花椒黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率為55.12%,該濃度下VC對(duì)DPPH自由基的清除率為80.65%,相同質(zhì)量濃度下VC對(duì)DPPH自由基的清除效果明顯優(yōu)于花椒黃酮。經(jīng)Graphpad Prism 7計(jì)算得花椒黃酮和抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率即IC50值分別為0.0819、0.0315 mg/mL??梢?,花椒黃酮對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力,但與VC相比能力較弱,可作為天然抗氧化劑應(yīng)用。

    圖3 花椒黃酮粗提物對(duì)DPPH自由基的清除能力

    2.4.2 羥基自由基清除能力 通過Fenton體系產(chǎn)生的羥基自由基與水楊酸混合后的產(chǎn)物在510 nm處有特殊吸收,加入自由基清除劑后,羥基自由基減少,與水楊酸的產(chǎn)物減少,吸光度降低。由圖4可知,花椒黃酮質(zhì)量濃度在0.01~1.0 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)羥基自由基的清除率隨著濃度的增加呈上升趨勢。0.2 mg/mL時(shí),花椒黃酮對(duì)羥基自由基的清除率為56.38%,而VC對(duì)羥基自由基的清除率為85.65%,清除效果明顯優(yōu)于花椒黃酮。經(jīng)計(jì)算得花椒黃酮和抗壞血酸對(duì)羥基自由基的半數(shù)清除率即IC50值分別為0.0376、0.0265 mg/mL。說明花椒黃酮提取物對(duì)羥基自由基具有一定清除能力。

    圖4 花椒黃酮粗提物對(duì)羥基自由基的清除能力

    3 結(jié)論

    本研究采用超聲波輔助提取花椒中黃酮成分,并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,考察乙醇濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)花椒黃酮提取得率的影響。結(jié)果表明,由響應(yīng)面分析得到的二次模型擬合度較高,影響花椒黃酮提取得率的因素表現(xiàn)為提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比;最佳提取工藝為乙醇濃度85%、料液比1∶20 g/mL、提取溫度70℃、提取時(shí)間35 min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),花椒黃酮的實(shí)際提取得率為12.16%,與預(yù)測值11.98%基本相符,說明所得花椒黃酮提取工藝可靠有效,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    體外抗氧化活性研究表明,花椒黃酮對(duì)DPPH自由基和羥基自由基具有一定清除能力,其IC50值分別為0.0819、0.0376 mg/mL。盡管花椒黃酮的抗氧化活性遠(yuǎn)低于L-抗壞血酸,但在一定濃度下花椒黃酮具有抑制自由基生成的作用,因此,花椒黃酮粗提物有望開發(fā)為天然抗氧化劑。后續(xù)將進(jìn)一步分離鑒定花椒黃酮粗提物,為花椒黃酮的綜合開發(fā)與利用提供理論支撐。

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