鹽堿土加沙后接種溶磷菌對綠豆根際土壤細(xì)菌多樣性的影響

周妍，王麗娜，張美珍，王思文，劉權(quán)，殷奎德

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163316）

鹽堿土中有機(jī)質(zhì)含量少，肥力低，普遍缺磷，導(dǎo)致作物不能生長［1］。中國鹽堿土面積約有1億hm2，占全球鹽堿地面積的10%［2］。隨著人口數(shù)量增加以及耕地面積的減少，鹽堿地的治理和改良越來越受到人們的重視。一般來說，土壤中微生物種類和數(shù)目與土壤肥力成正相關(guān)［3］。土壤微生物作為土壤肥力的重要指標(biāo)，數(shù)量巨大，種類繁多，其與植物根系相互作用、相互促進(jìn)，與植物的生長、繁殖和代謝活動密切相關(guān)，是土壤中最活躍的組成成分，在土壤功能方面發(fā)揮重要作用。土壤鹽堿化可改變土壤理化性質(zhì)，直接影響微生物的生存［4］，也可以間接影響土壤微生物的生境，使微生物的種群、數(shù)量和活性等受到損害，導(dǎo)致土壤微生態(tài)失衡，從而影響作物產(chǎn)量。

相關(guān)研究表明，根際微生物數(shù)量多、生長繁殖快、與根系的相互作用強(qiáng)、代謝活性強(qiáng)，對土壤有機(jī)物質(zhì)的分解、氮素的循環(huán)、礦質(zhì)元素的轉(zhuǎn)換以及植物營養(yǎng)、生長和發(fā)育、植物病害等都有重要的影響［5，6］。根際微生物包括原生動物、真菌、細(xì)菌等，其中細(xì)菌在根際微生物中占有最多的類群，細(xì)菌生長快，代謝旺盛，在一定程度上反映了土壤質(zhì)量及微生物群落的穩(wěn)定性［7］。細(xì)菌是根際土壤的重要組成之一，發(fā)揮著重要的生態(tài)功能，在維持土壤結(jié)構(gòu)和養(yǎng)分上有著特定的作用。

楊劍芳等［8］在我國不同地區(qū)的鹽堿土中分離獲得48株細(xì)菌，耐鹽堿能力較強(qiáng)，能夠?qū)㈦y溶性元素如P、K轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的可溶性元素，其代謝產(chǎn)物多糖和有機(jī)酸可有效抑制病原菌的生長，應(yīng)用前景廣闊。溶磷微生物不僅能增加土壤中可溶性磷的含量，也能在植物根際周圍形成優(yōu)勢菌群，增強(qiáng)植物抗病能力［9］。余旋等［10］研究表明，施用溶磷菌劑能有效提高美國山核桃根際區(qū)域的微生物數(shù)量，增強(qiáng)土壤磷酸酶及脲酶活性。因此，從土壤中篩選高效溶磷微生物生產(chǎn)生物肥料，可有效促進(jìn)植物根系生長，減少環(huán)境污染，帶來更多經(jīng)濟(jì)效益以及生態(tài)效益。Shi等［11］的研究發(fā)現(xiàn)青蒿根際細(xì)菌和真菌相互作用可以促進(jìn)植物生長，同時能影響細(xì)菌和真菌的群落多樣性。目前，對溶磷菌劑的研究主要集中在對作物生長、營養(yǎng)吸收及產(chǎn)量和品質(zhì)的影響上，而對根際土壤微生態(tài)環(huán)境的影響以及菌株耐鹽堿方面的報道很少。本研究從鹽堿草原上堿草和堿蓬根際土中篩選分離得到3株具有溶磷功能的菌株，并利用盆栽試驗(yàn)探討其溶磷作用以及對綠豆根際微生物群落多樣性的影響，以期為進(jìn)一步獲得高效溶磷菌、研制耐鹽堿溶磷生物制劑產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 種植土 于2020年7月10日在黑龍江省大慶市龍鳳區(qū)的草原上取土，植被是羊草，挖取0～20 cm土壤，去除草根等雜物備用。鹽堿土堿解氮（AN）、有效磷（OP）、速效鉀（AK）含量分別為283.00、20.30、382.00 mg／kg，有機(jī)質(zhì)（SOM）含量32.70 g／kg，可溶性鹽（S）含量0.16%，pH＝8.70。取河沙用水清洗3遍后烘干，將鹽堿土與沙子1∶1等體積混勻裝入盆中，每盆混合土7 kg，用于綠豆的種植。

1.1.2 營養(yǎng)液 Hoagland全營養(yǎng)液按照陳超等［12］的方法配制，缺磷營養(yǎng)液是將Hoagland正常營養(yǎng)液中的磷酸銨換成氯化銨，其它成分不變。1.1.3 綠豆品種 試驗(yàn)用綠豆品種為“小明綠”，由國家雜糧工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.4 菌種來源 試驗(yàn)菌株JC8、JC11和JP8由本實(shí)驗(yàn)室前期從大慶鹽堿草原上植物根際土篩選獲得，菌株JC8為假單胞菌（Pseudomonas sp.），JC11為不動桿菌（Acinetobacter sp.），JP8為微桿菌（Microbacterium sp.），經(jīng)過前期測定發(fā)現(xiàn)JC8、JC11和JP8的溶有機(jī)磷量分別達(dá)414.18、482.86、428.30 mg／L，經(jīng)耐鹽堿試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3株菌均能在pH＝11、氯化鈉濃度為11%的培養(yǎng)基上生長。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定 土壤pH值、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量參照鮑士旦［13］的方法進(jìn)行測定。

1.2.2 溶磷菌溶磷能力試驗(yàn) 用鹽堿土和沙子混合作為綠豆盆栽用土，盆栽試驗(yàn)共設(shè)3個接菌處理和兩個對照，接菌組分別為接種JC8（T1）、JC11（T2）、JP8（T3）菌株并澆灌缺磷營養(yǎng)液，對照CK1不接菌澆灌缺磷營養(yǎng)液，對照CK2不接菌澆灌全營養(yǎng)液。每盆種植綠豆30粒，在播種前一天施入菌液和營養(yǎng)液；播種17 d后再施入一次菌液和營養(yǎng)液。菌液制備按照Kwak等［14］的方法進(jìn)行，菌液接種量為108cfu／g；Hoagland營養(yǎng)液稀釋4倍澆灌。置于室外培養(yǎng)，正常澆水，種植35 d后統(tǒng)計(jì)植株的各項(xiàng)生長指標(biāo)。

1.2.3 根際土壤細(xì)菌多樣性分析 （1）土壤總DNA提取、擴(kuò)增與測序：根際土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增以及熒光定量參照向君亮等［15］的方法進(jìn)行，切膠回收PCR產(chǎn)物，電泳檢測后，采用Illumina HISeq平臺進(jìn)行測序。

（2）序列分析：測序完成后，在美吉云平臺上進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，優(yōu)化后的數(shù)據(jù)用QIIME進(jìn)行質(zhì)控過濾以及OTU聚類，完成后在Silva數(shù)據(jù)庫中比對，對各個樣本的OTU在自己分類等級上的群落組成進(jìn)行注釋。樣本物種組成分析、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析等均在美吉I－Sanger云平臺上進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析采用Duncan’s新復(fù)極差法和LSD法，采用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌后土壤理化性質(zhì)

如表1所示，接菌后土壤pH 值顯著下降（P<0.05））；T3處理的可溶性鹽含量與CK1相比顯著下降（P<0.05）；接菌處理均顯著（P<0.05）增加了AN、OP、AK和SOM含量。

表1 不同處理土壤理化性質(zhì)

2.2 溶磷菌溶磷作用

綠豆各項(xiàng)生長指標(biāo)的測定結(jié)果如表2所示，接種溶磷菌后，綠豆幼苗的根長、植株干重和鮮重以及根干重和鮮重顯著增加；與CK1相比，T1、T2、T3處理根長分別增加1.59、1.85、2.22倍，植株鮮重分別增加1.97、2.39、3.23倍，根鮮重分別增加2.40、2.80、4.60倍；T1、T2、T3處理與CK2相比根長分別增加72.05%、89.39%、1.14倍，植株鮮重分別增加87.76%、1.14倍、1.67倍，根鮮重分別增加2.40、2.80、4.60倍。表明接種溶磷菌后，土壤中難溶的磷酸鹽被溶磷菌分解為可被利用的磷，顯著改善綠豆在鹽堿土中的生長狀況，緩解了鹽堿脅迫對綠豆生長的抑制作用，增強(qiáng)了綠豆對鹽堿脅迫的抵抗能力。

表2 溶磷菌對綠豆植株形態(tài)指標(biāo)的影響

2.3 土壤細(xì)菌多樣性分析

2.3.1 OTU分析 5組樣本的OTU數(shù)目為T2＞T3＞T1＞CK2＞CK1（圖1），說明接菌株JC11的綠豆根際土壤的細(xì)菌類群最為豐富，缺磷營養(yǎng)液培養(yǎng)的綠豆根際土壤細(xì)菌類群最少；CK1和CK2處理獨(dú)有的OTU分別為24個和26個，T1、T2、T3處理獨(dú)有的OTU分別為108、138、116個。綜合看來，施用溶磷菌的綠豆根際土壤樣品細(xì)菌數(shù)量同兩對照相比差異較為明顯。

圖1 土壤樣品細(xì)菌OTU數(shù)量韋恩圖

2.3.2 土壤樣品Alpha多樣性與Beta多樣性 Alpha多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性。群落豐富度指數(shù)主要包括Chao 1指數(shù)和Ace指數(shù)，指數(shù)越大代表物種總數(shù)越多，豐富度越高。群落多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Shannon指數(shù)反映了在群落中隨機(jī)選擇的個體的不確定性，指數(shù)值越高，不確定性越大，多樣性越高；Simpson指數(shù)反映了優(yōu)勢種在群落中的地位和作用，其數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。

由表3看出，T1、T2、T3處理的Shannon指數(shù)均顯著高于對照組，Simpson指數(shù)均顯著低于對照組，說明接菌后物種群落多樣性增加；Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)的趨勢與Shannon指數(shù)相同，說明接菌處理后物種總數(shù)上升，群落豐富度提高。

表3 綠豆根際土壤樣品Alpha多樣性指數(shù)

Beta多樣性分析結(jié)果（圖2a）顯示，兩個主坐標(biāo)分別解釋了44.62%、25.20%的變異度，5組綠豆根際土壤樣本之間距離相對較小，說明各組樣本內(nèi)部菌群結(jié)構(gòu)較為一致；但對照與不同處理組分別在不同的象限，且存在著較大距離，說明對照與各處理在物種組成、相對豐度和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上有著較大差異。從聚類分析圖（圖2b）中可以看出，各組樣品分別聚類在一個大的分支上，說明組內(nèi)樣本的物種組成、相對豐度和系統(tǒng)發(fā)育相似，而組間差異較大。

圖2 不同處理鹽堿土中細(xì)菌組成PCoA（a）和聚類分析（b）

2.3.3 物種組成分析 門水平下細(xì)菌群落組成如圖3所示，主要細(xì)菌門類有10個，分別為放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、粘球菌門（Myxococcota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）以及Methylomirabilota。在所有樣品中，放線菌門和變形菌門均為優(yōu)勢菌門，相對豐度占20%以上。溶磷菌劑施入增加了變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、綠彎菌門和擬桿菌門的相對豐度，而芽單胞菌門、粘球菌門和Methylomirabilota的豐度下降。

圖3 綠豆根際土壤中門分類水平上的細(xì)菌群落組成

屬水平下細(xì)菌群落組成結(jié)果如圖4所示，共檢測到30個屬，施入菌劑增加了芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度；在3個接菌組中發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬（Pseudomonas）及不動桿菌屬（Acinetobacter），而且T1組中假單胞菌屬相對豐度較高。

圖4 綠豆根際土壤中屬分類水平上的細(xì)菌群落組成

2.3.4 差異物種分析 LEfSe采用線性判別分析（LDA）檢測接種溶磷菌與未接種菌的綠豆根際土壤樣品之間豐度具有顯著差異的群體或物種。如圖5所示，共有65種細(xì)菌在不同組土壤樣品中表現(xiàn)出明顯的差異，LDA閾值為2.2。

圖5 差異物種LEfSe分析及LDA判別結(jié)果

在缺磷營養(yǎng)液的土壤中（CK1），共發(fā)現(xiàn)4個標(biāo)志性細(xì)菌群落，包括g＿Salegentibacter、g＿Tahibacter、g＿Halobacillus和g＿norank＿f＿Fimbriimonadaceae；CK2處理土壤中發(fā)現(xiàn)13個標(biāo)志性細(xì)菌群落，包括p＿Chloroflexi、c＿Anaerolineae、c＿Vicinamibacteria、o＿Vicinamibacterales等；接種菌株JC8的土壤中（T1）發(fā)現(xiàn)14個標(biāo)志性細(xì)菌群落，包括g＿Acinetobacter、f＿M(jìn)oraxellaceae、o＿Flavobacteriales、p＿Bdellovibrionota等；接種菌株JC11的土壤中（T2）發(fā)現(xiàn)16個標(biāo)志性細(xì)菌群落，包括p＿Bacteroidota、p＿Cyanobacteria、g＿Aureispira、f＿M(jìn)icrocystaceae等；g＿Bacillus、g＿Thermomonas、f＿Nitrococcaceae、o＿norank＿c＿＿Sericytochromatia等18個標(biāo)志性細(xì)菌群落在接種菌株JP8的土壤中（T3）聚集。

2.3.5 冗余分析 通過冗余分析（RDA）法研究了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成與環(huán)境因子之間的關(guān)系，土壤理化性質(zhì)包括可溶性鹽含量、pH值、堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)。如圖6所示，可溶性鹽含量、pH值與堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)；3組接菌處理中部分樣本與堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，而兩個對照組與堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)。對環(huán)境因子與門水平下相對豐度前5的細(xì)菌之間的關(guān)系進(jìn)行分析表明，放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）和綠彎菌門（Chloroflexi）與可溶性鹽含量和pH值呈正相關(guān)，與土壤肥力指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)；而厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）與可溶性鹽含量和pH值呈負(fù)相關(guān)，與土壤肥力指標(biāo)呈正相關(guān)。

圖6 土壤理化性質(zhì)對菌群結(jié)構(gòu)的影響

3 討論與結(jié)論

鹽堿土中的硫酸鹽、氯化物、重碳酸鹽等成分可對土壤物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)、作物生長等造成嚴(yán)重的不良影響；極大地破壞土壤的團(tuán)粒密度、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及滲透力，并且抑制土壤微生物的呼吸作用及β－葡糖苷酶、堿性磷酸酶等水解酶的活性［16］，鹽堿化問題已成為目前全球土壤利用最嚴(yán)重的問題之一。許多研究者為改良并合理利用鹽堿地開展了廣泛研究，施用微生物菌劑被認(rèn)為是一種可以顯著降低土壤pH值和鹽含量，并提高鹽堿地植物成活率的有效手段［17－20］。

劉環(huán)等［21］就耐鹽堿菌株YM6對玉米幼苗生長的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種菌株后玉米幼苗地上及地下部分干重、鮮重以及株高均顯著大于對照組。Majeed等［22］從小麥根際分離得到多株具有促生功能的菌，接種于植物后發(fā)現(xiàn)根長以及地上部生物量均顯著增加。本研究在輕度鹽堿土加沙混合后種植綠豆，缺磷營養(yǎng)液澆灌條件下接種溶磷菌株后綠豆生長良好，說明溶磷菌具有溶磷作用，并能增強(qiáng)綠豆耐鹽堿能力，在鹽堿脅迫下，綠豆幼苗根鮮重、干重以及植株干重、鮮重均顯著提高。

微生物分泌代謝物可影響土壤結(jié)構(gòu)形成，同時土壤結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化又間接說明了土壤微生物的活動狀況［23，24］。本研究通過土壤接種溶磷菌株后細(xì)菌多樣性的變化分析溶磷菌對土壤中原生微生物的影響，發(fā)現(xiàn)接種溶磷菌的根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以變形菌門、酸桿菌門和放線菌門為主，與Liu等［25］的結(jié)果一致。張智猛等［26］的研究發(fā)現(xiàn)不同含鹽量的濱海鹽土、內(nèi)陸鹽堿土和中等肥力非鹽堿土壤樣本微生物群落結(jié)構(gòu)在綱水平存在明顯差異，以變形菌門和放線菌門為主。Zhou等［27］的研究發(fā)現(xiàn)青藏高原退化草原土壤中細(xì)菌群落以放線菌門為主，其次是變形菌門。

土壤中變形菌、酸桿菌和放線菌具有重要作用，比如放線菌能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)、抗生素及具有潛在用途的極端酶，且能在極端環(huán)境中生長；變形菌可用于促進(jìn)氮肥利用、植物病蟲害防治、土壤修復(fù)和復(fù)雜污染物降解等；酸桿菌在土壤物質(zhì)循環(huán)、活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生及與其它微生物互作中起到非常重要的作用。其它豐度較高的菌門還包括浮霉菌門、厚壁菌門和綠彎菌門等，這些細(xì)菌在土壤生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用，能夠參與碳循環(huán)和能量循環(huán)等。鹽堿土中可供微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)很少，但寡營養(yǎng)細(xì)菌（浮霉菌門和厚壁菌門）卻能從大氣中攝取營養(yǎng)物質(zhì)，利用大氣中的少量碳源、氮源維持正常生長［28］。這說明寡營養(yǎng)細(xì)菌更適合在極端環(huán)境下生存。

冗余分析發(fā)現(xiàn)可溶性鹽含量、pH值與堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)，說明高pH值和可溶性鹽含量會使土壤中養(yǎng)分含量降低；接菌的3組樣本與堿解氮、有效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)，而兩個對照組與之呈負(fù)相關(guān)，說明溶磷菌株能夠分泌一些有機(jī)酸，降低土壤中可溶性鹽含量和pH值；放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門與可溶性鹽含量和pH值呈正相關(guān)，與土壤肥力指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，說明其更耐鹽堿環(huán)境，尤其是放線菌門具有較強(qiáng)的DNA修復(fù)能力和極端環(huán)境下的生存能力；而厚壁菌門和變形菌門與可溶性鹽含量和pH值呈負(fù)相關(guān)，與土壤肥力指標(biāo)呈正相關(guān)，在物種組成中發(fā)現(xiàn)接菌后鹽堿土壤中的厚壁菌門和變形菌門相對豐度顯著增加，說明其能在鹽堿土中生長。綜上說明土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分情況是影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因素。

本研究通過盆栽試驗(yàn)證明3株耐鹽堿高效溶磷菌對綠豆均有明顯的溶磷促生特性；高通量測序后分析接菌土壤OTU數(shù)目、多樣性指數(shù)、群落組成、差異物種并進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）和冗余分析（RDA），發(fā)現(xiàn)接種溶磷菌株的土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度更高，變形菌門和放線菌門是優(yōu)勢菌門，土壤理化性質(zhì)影響細(xì)菌群落組成。