天津野生山櫻花組織培養(yǎng)與再生體系的建立

高英，劉昊，楊利云，楊翔祥，夏蕊，楊麗芳

（1.天津農(nóng)學院園藝園林學院，天津 300392；2.天津市農(nóng)業(yè)科學院林業(yè)果樹研究所，天津 300384）

山櫻花（Cerasus serrulate L.）又名山櫻、野山櫻，屬于薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus）植物，是櫻花的野生種，為落葉小喬木。我國北方地區(qū)罕見野生山櫻花分布，2018年在天津薊州八仙山國家自然保護區(qū)首次發(fā)現(xiàn)野生種群，是適合當?shù)丨h(huán)境的地理變異類型。該種野生山櫻花樹型優(yōu)美，花型獨特，花瓣倒卵形，先端有凹缺，花瓣白色，部分先端呈淡粉色，具有較強的抗病蟲害能力、適應(yīng)性和抗逆性，蘊含重要的櫻花基因資源，是重要而稀少的櫻屬觀賞植物和種質(zhì)資源，具有潛在的開發(fā)利用前景［1，2］。目前，北方野生山櫻花的繁殖方式主要以實生繁育為主，無性繁殖受制于砧穗親和性和插條發(fā)育程度還存在繁育率低和苗木整齊度差等問題，限制了野生山櫻花的資源保護及開發(fā)利用。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅具有繁殖快、成苗周期短的優(yōu)點，而且能夠保持優(yōu)良遺傳性狀的穩(wěn)定性，可以為山櫻花快速繁殖和資源保存提供有效途徑［3－5］。已有研究建立了多種櫻屬植物的組培快繁體系［6－12］，但對野生櫻花的研究均是南方分布區(qū)的福建山櫻花和鐘花櫻［13－15］，對北方野生山櫻花資源的研究尚處于起步階段。本研究在借鑒多種櫻花組培快繁研究的基礎(chǔ)上，以采集于天津市薊州山區(qū)的野生山櫻花為試材，對叢生芽增殖和生根誘導培養(yǎng)的激素組合以及煉苗時長和移栽基質(zhì)等進行篩選試驗，以期建立該野生山櫻花的組培快繁體系，為其資源保護和有序利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樹為天津市薊州山區(qū)的野生山櫻花（Cerasus serrulate L.）成齡樹。于2020年5月抽生新梢后，剪取5.0～6.0 cm半木質(zhì)化嫩梢進行組織培養(yǎng)。

1.2 外植體消毒和莖段腋芽誘導

用洗滌劑洗去新采嫩梢表面污漬，剪掉葉片，保留葉柄1～2 cm，用流水沖洗2 h后，在超凈臺上將嫩梢浸入70%乙醇溶液中30 s，用無菌水沖洗2～3次，再放入0.3%過氧乙酸溶液中消毒2次，每次10 min，期間不斷搖動或攪拌；用無菌水清洗3～4次，再用無菌濾紙吸干水分。剪取1.0～2.0 cm的帶芽莖段，接種在添加2 mg·L－16－芐氨基腺嘌呤（6－BA）和0.1 mg·L－1萘乙酸（NAA）的MS培養(yǎng)基上，進行腋芽誘導。

1.3 叢生芽高效增殖培養(yǎng)的激素組合篩選

待誘導出的腋芽長至1.0～1.5 cm時，將萌發(fā)的新梢剪下，接種到添加不同種類、不同濃度激素的叢生芽增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。本試驗在已有研究基礎(chǔ)上，以MS為基本培養(yǎng)基，確定NAA濃度為0.1 mg·L－1，另外選擇6－BA、TDZ和GA3，分別設(shè)計不同濃度，形成多個處理組合，見表1。每瓶接入5個莖段，每個處理共接種24瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計長度大于5 mm的叢生芽數(shù)量，計算增殖系數(shù)和玻璃化率［13］。

表1 叢生芽增殖培養(yǎng)基添加激素的種類及濃度

增殖系數(shù)＝平均每瓶30天內(nèi)形成的有效芽苗數(shù)／接種腋芽數(shù)；

玻璃化率（%）＝培養(yǎng)30天后的玻璃化芽苗總數(shù)／培養(yǎng)30天后的有效芽苗總數(shù)×100。

1.4 組培苗生根誘導培養(yǎng)基的激素濃度及支撐物篩選

待上述叢生芽長至3.0～4.0 cm時進行生根誘導培養(yǎng)。本試驗以1／2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計支撐物為7.0 g·L－1瓊脂或2.5 g干水苔、添加IBA和NAA的濃度配比7種（表2），另添加15 g·L－1蔗糖，調(diào)pH至6.0，在16 h光培養(yǎng)、8 h暗培養(yǎng)、光照強度2 000～3 000 lx、（25±2）℃、空氣相對濕度50% ～60%條件下培養(yǎng)。每瓶接種3個芽苗，每個處理共接種24瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后調(diào)查單株不定根數(shù)、單株側(cè)根數(shù)及生長狀況。

表2 生根培養(yǎng)基添加激素的種類及濃度 （mg·L－1）

1.5 移栽基質(zhì)與煉苗時長的確定

當上述生根培養(yǎng)基中組培苗不定根長約為5.0 cm時，進行移栽。栽前，在室溫（23～25℃）自然光照條件下，對組培苗進行閉瓶煉苗，移栽前一天打開瓶蓋。移栽時，用鑷子從培養(yǎng)瓶中小心取出組培苗，用清水洗凈根上黏附的培養(yǎng)基，然后在百菌清500倍液中蘸根1～2 min，栽入已備好的育苗盤基質(zhì)中。

試驗設(shè)置4種育苗基質(zhì)：蛭石＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1）、蛭石＋草炭（體積比2∶1）、草炭＋珍珠巖（體積比1∶1）和營養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1）；煉苗天數(shù)設(shè)置0、5、10 d。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)移栽組培苗30株。于移栽第30天統(tǒng)計組培苗成活情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 25.0進行方差分析，用Duncan’s法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類激素組合對野生山櫻花叢生芽增殖的影響

由表3可知，僅添加6－BA與僅添加TDZ的叢生芽增殖系數(shù)分別以0.50 mg·L－1和2.00 mg·L－1時最高，分別為2.25和2.46，但兩者之間及各濃度處理之間均無顯著差異。而增添GA3能夠提高增殖系數(shù)，以1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ（Z15）的增殖系數(shù)最大，為3.96，其次為0.25 mg·L－1GA3＋1.00 mg·L－16－BA（Z9）、1.00 mg·L－1GA3＋1.00 mg·L－16－BA（Z11）和0.50 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ（Z14），增殖系數(shù)在3.15～3.28范圍內(nèi)，4種組合間無顯著差異。但Z15、Z14、Z11的玻璃化率顯著低于Z9（95%），分別為6%、7%、14%，遠低于其他激素組合。僅添加6－BA或TDZ的芽苗葉片增大明顯且嫩綠但玻璃化率高且程度深，輕微程度平均占比分別達到0.40和0.29，嚴重程度平均占比分別達到0.17和0.12；增添GA3的芽苗葉片大且黃綠，但玻璃化程度明顯降低，輕微程度平均占比分別降至0.38和0.22，嚴重程度平均占比分別降至0.05和0.02。

表3 不同種類激素組合對野生山櫻花叢生芽增殖的影響

綜合分析，Z15激素組合，即1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ ＋0.1 mg·L－1NAA更適宜于天津野生山櫻花莖段的增殖生長。各種生長情況的增殖苗見圖1。

2.2 不同生長素組合及不同培養(yǎng)基支撐物對野生山櫻花組培苗生根的影響

2.2.1 不同濃度IBA對生根的影響 由表4可知，在固定NAA濃度為0.10 mg·L－1的前提下，以瓊脂為培養(yǎng)基支撐物時，添加0.75 mg·L－1IBA（S4）的野生山櫻花組培苗單株側(cè)根數(shù)最多，組培苗生長健壯，但生根率低，僅40.00%；而添加0.25 mg·L－1IBA（S2）的生根率最高，達75.00%，單株不定根數(shù)和單株側(cè)根數(shù)均較高，生根效果最好，且組培苗生長較健壯。以水苔為培養(yǎng)基支撐物時，添加0.10 mg·L－1IBA（S1）的生根率、單株不定根數(shù)、單株側(cè)根數(shù)均最高，分別達94.59%、3條、10條，均顯著高于其他處理，生根效果最好，且組培苗生長很健壯。

表4 不同濃度IBA對野生山櫻花生根和生長狀況的影響

2.2.2 不同濃度NAA對生根的影響 由表5可知，當固定IBA濃度為0.10 mg·L－1時，在以瓊脂為支撐物的培養(yǎng)基中添加0.25 mg·L－1NAA（S5）時，野生山櫻花組培苗的生根率最高，達91.30%，單株不定根數(shù)最多（9條），顯著多于其他處理，單株側(cè)根數(shù)較少，組培苗生長很健壯；在以水苔為支撐物的培養(yǎng)基中添加0.10、0.50、0.75 mg·L－1NAA的生根率均超過90%，以添加0.10 mg·L－1NAA（S1）的值最高，且其單株不定根數(shù)、單株側(cè)根數(shù)均明顯高于其他處理，組培苗生長很健壯。

表5 不同濃度NAA對野生山櫻花生根和生長狀況的影響

綜合上述分析，以水苔為支撐物、添加0.10 mg·L－1IBA＋0.10 mg·L－1NAA的1／2MS培養(yǎng)基最適宜野生山櫻花組培苗生根。組培苗的不同生根情況見圖2。

圖2 野生山櫻花組培生根

2.2.3 不同支撐物對組培苗根形態(tài)的影響 由圖3可知，以瓊脂為支撐物的組培苗根呈白色，表面有透明物質(zhì)包裹（圖3A）；而以水苔為支撐物的組培苗靠近根尖部分呈黃白色，靠近莖基部呈黃褐色，表面無透明物質(zhì)（圖3B）。在顯微鏡下觀察，以瓊脂為支撐物培養(yǎng)的組培苗根系表面光滑（圖3C），而以水苔為支撐物培養(yǎng)的組培苗根系表面密布根毛（圖3D）。另外，比較兩種支撐物上的組培苗發(fā)現(xiàn)，以瓊脂為支撐物的組培苗莖基本沒有變化，而以水苔為支撐物的組培苗莖有一定的伸長。

圖3 不同培養(yǎng)基支撐物的組培苗生根情況

2.3 不同基質(zhì)對野生山櫻花移栽成活率及幼苗生長的影響

由表6可知，基質(zhì)為蛭石＋珍珠巖＋草炭時野生山櫻花的移栽成活率最高，達98.21%，顯著高于其他基質(zhì)處理；基質(zhì)為營養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭和草炭＋珍珠巖的組培苗成活率次之，分別為82.14%和76.79%，二者間差異不顯著。

表6 不同基質(zhì)對野生山櫻花移栽后生長的影響

移栽成活植株葉片數(shù)量整體有所減少，其中蛭石＋珍珠巖＋草炭和草炭＋珍珠巖處理的葉片減少1片，而其余兩種基質(zhì)處理的葉片減少3～4片。葉片減少主要是因為移栽后基部老葉脫落，而頂部新葉尚未發(fā)出。

移栽后野生山櫻花的莖粗基本無變化，株高增加不明顯，但冠幅明顯增加。不同基質(zhì)處理間，蛭石＋珍珠巖＋草炭的株高增量最大，為2.64 mm，其次為營養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭，兩者間差異不顯著；營養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭的冠幅增量最大，達43.62 mm，草炭＋珍珠巖（36.58 mm）和蛭石＋珍珠巖＋草炭（35.68 mm）次之，蛭石＋草炭最低（27.99 mm）；不同基質(zhì)處理間莖粗增量差異沒有顯著差異。

綜合各指標，以蛭石＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1）為基質(zhì)較適宜野生山櫻花組培苗移栽成活。

2.4 不同煉苗時間對野生山櫻花移栽成活率及幼苗生長的影響

由表7可知，煉苗能明顯提高組培苗的移栽成活率，以水苔為生根培養(yǎng)基支撐物的組培苗移栽成活率更高，煉苗5 d移栽成活率達80%，與煉苗10 d的成活率不存在顯著性差異。移栽成活幼苗的葉片數(shù)量整體有所減少（0～2片），莖粗基本無變化；株高增加1.73～3.87 mm，以水苔為支撐物煉苗10 d的增量最大，但與煉苗5 d的株高不存在顯著性差異；冠幅明顯增加，增量為20.89～33.31 mm。綜合分析，以水苔為生根培養(yǎng)支撐物、煉苗5 d較適宜野生山櫻花組培苗移栽成活，且移栽后生長狀況較好。

表7 不同煉苗時間對野生山櫻花移栽后生長情況的影響

3 討論

細胞分裂素與生長素的比值決定了芽和根的分化，細胞分裂素在芽的增殖和生長中起決定性作用［15］。6－BA和TDZ是組織培養(yǎng)中常用的細胞分裂素類物質(zhì)，對植物的形態(tài)發(fā)生起有效調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用范圍遍及草本植物到木本植物［16］。在櫻屬植物再生的研究中，TDZ對誘導酸櫻桃［17］離體器官產(chǎn)生不定芽具有較強的活性，而6－BA對誘導馬哈利櫻桃［18］離體葉片再生更有效。本研究發(fā)現(xiàn)，在野生山櫻花莖段增殖時使用6－BA或TDZ均出現(xiàn)了不同程度的組培苗玻璃化現(xiàn)象，玻璃化率最高達到87%，這與前人在山櫻花［3］上的試驗結(jié)果一致；使用6－BA雖然繁殖系數(shù)較高，但組培苗仍有節(jié)間短的現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加GA3可以明顯增加垂枝櫻花的增殖系數(shù)［19］，GA3濃度達到0.3 mg·L－1對福建山櫻花叢生芽增殖有明顯促進作用［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)，增添GA3能明顯提高野生山櫻花的增殖系數(shù)，降低不定芽玻璃化率，改善節(jié)間短的現(xiàn)象，以1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ＋0.1 mg·L－1NAA對野生山櫻花叢生芽增殖的效果最好。

IBA和NAA是誘導木本植物不定根形成的重要植物生長調(diào)節(jié)劑［21，22］，作用效果存在品種差異性，如在微毛櫻生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L－1IBA可有效誘導組培苗生根且生根率最高可達100%［7］，而在櫻花生根培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L－1IBA才顯著提高組培苗的生根率［4］。對福建山櫻花的研究發(fā)現(xiàn)，IBA和NAA配合使用可顯著提高其根系形成速率，且根系生長粗壯，當兩者配比為1.0 mg·L－1NAA＋1.0 mg·L－1IBA時，生根率達90%以上［14］。本研究也證實兩種生長素配合使用可以促進野生山櫻花組培苗不定根的形成，但適宜的濃度相對較低，0.10 mg·L－1NAA＋0.10 mg·L－1IBA的生根表現(xiàn)最好，生根率最高達到94.59%，單株不定根數(shù)為3條，單株側(cè)根數(shù)可達10條，植株生長很健壯。本研究結(jié)果也表明野生山櫻花不定根發(fā)生屬于誘導生根型，且對生長素較敏感。

本研究使用水苔作為培養(yǎng)基支撐物，在高等木本植物的組織培養(yǎng)中尚屬罕見，結(jié)果表明水苔較瓊脂對野生山櫻花的生根效果有明顯改善，生根率更高，顯微鏡下可觀察到側(cè)根上長出了根毛。

移栽基質(zhì)及煉苗時長對組培苗的移栽成活起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明添加了珍珠巖的基質(zhì)對野生山櫻花的移栽成活率具有明顯提高作用，這與在日本晚櫻［23］上的試驗結(jié)果相似。有研究表明草莓閉瓶煉苗3 d，獼猴桃閉瓶煉苗3～5 d、開瓶煉苗2 d，大櫻桃開瓶煉苗10～15 d均可提高其組培苗的移栽成活率［24－26］。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，增加煉苗時長有利于野生山櫻花組培苗移栽成活，但采用水苔做培養(yǎng)基支撐物可大大縮短煉苗時長且提高成活率，這可能與水苔營造的暗生長環(huán)境和溶氧量較高有利于側(cè)根根毛發(fā)生有關(guān)。

4 結(jié)論

天津野生山櫻花叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS＋0.50 mg·L－1TDZ＋1.00 mg·L－1GA3＋0.1 mg·L－1NAA，最佳生根培養(yǎng)基為用水苔作為支撐物的1／2MS＋0.10 mg·L－1IBA ＋0.10 mg·L－1NAA，最佳移栽基質(zhì)為蛭石＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1），移栽前閉瓶煉苗5 d。野生山櫻花組培體系的建立為其大量快速繁殖奠定了基礎(chǔ)。