微波輔助提取辣木葉總黃酮工藝優(yōu)化及其抑菌和抗氧化活性研究

楊麗華 董曉倩 董啟露 李曉嬌

(保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000)

辣木(MornigaoleiferaLam.)為辣木科辣木屬的一種喬木，因其根有辛辣味而得名，辣木的根、葉和嫩果可以食用，種子含油，可作為潤滑油和定香劑[1]。辣木原產(chǎn)印度，近年來在中國云南、廣西、廣東、海南等地區(qū)均有引種[2]。辣木葉中富含多種營養(yǎng)成分和多種活性成分[2-5]，具有降血糖、抗氧化、抗癌、消炎抑菌、降血壓和降膽固醇等作用[5-9]，于2012年被批準(zhǔn)為新資源食品。目前，已從辣木黃酮類中分離鑒定出蘆丁、多花薔薇苷、牡荊素、槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-丙二?；禾擒?、異鼠李素、芹菜素、表兒茶素等多種黃酮類化合物，這些物質(zhì)多以苷類形式存在[8-11]。

目前，應(yīng)用于辣木總黃酮提取的方法有溶劑浸提法[12]、超聲波輔助提取法[12-17]、微波輔助提取法[18]、酶解提取法[19]、亞臨界流體萃取法[20]和常壓內(nèi)部沸騰法[21]等，其中以溶劑浸提和超聲波輔助提取的報(bào)道較多。張善添等[12]采用加熱回流水提、加熱回流水提醇沉、70%乙醇加熱回流提取、超聲加熱水提、超聲加熱醇提、超聲醇提等方法提取辣木葉中的總黃酮，得率分別為1.57%，1.82%，3.25%，1.91%，3.21%，2.64%；吉莉莉等[18]用乙醇浸提和微波輔助法提取辣木葉總黃酮，得率分別為2.60%，3.45%；張展適等[22]利用超聲波輔助法的得率僅為0.84%；上述提取率較低，且關(guān)于辣木葉總黃酮抑菌活性的報(bào)道較少。王遠(yuǎn)[10]研究表明，辣木葉總黃酮的抑菌效果為大腸桿菌>枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌；馬金魁等[14]研究表明，辣木葉總黃酮的抑菌效果為白色假絲酵母>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌；王麗虹等[23]研究表明，辣木葉總黃酮對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌，對(duì)大腸桿菌則無抑制作用；以上試驗(yàn)結(jié)果差異較大。

微波產(chǎn)生的高頻電磁波可以加速細(xì)胞破裂，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)的流出，所以微波輔助提取能縮短提取時(shí)間、提高提取效率、減少溶劑消耗，并減少活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞[24-25]。研究擬利用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取工藝，采用濾紙片法測(cè)定辣木葉總黃酮對(duì)3種供試菌種的抑菌能力，并考察其體外抗氧化活性，旨在為辣木葉總黃酮的高效提取及進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉：2020年8月采摘于保山市潞江壩，經(jīng)保山學(xué)院汪建云教授鑒定為辣木科辣木屬植物辣木(MornigaoleiferaLam.)；

大腸桿菌(Echerichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacilussubtilis)：保山學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr. Ehrenstofer Gmbh公司；

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；

牛肉膏：廣東環(huán)凱微生物有限公司；

蛋白胨：北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器和設(shè)備

高速萬能粉碎機(jī)：DFY-800型，杭州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；

微波爐：MW20-M605型，格蘭仕微波爐電器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV5000型，安徽皖儀科技有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-4型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：雙A型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1001型，上海泉杰儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-758KB型，上海申安醫(yī)療器械廠；

恒溫振蕩培養(yǎng)箱：SPX型，波東南儀器有限公司；

冷凍干燥儀：ZX-LGJ-IA型，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參照王遠(yuǎn)[10]的方法，得到線性回歸方程y=9.55x+0.000 3，R2= 0.999 4。

1.3.2 辣木葉總黃酮提取 將辣木葉陰干后粉碎，過60目篩。稱取適量辣木葉粉末置于索氏提取器中，加入石油醚，回流提取2 h，抽濾烘干后即得辣木葉脫脂粉末。精確稱取1.00 g辣木葉脫脂粉末進(jìn)行微波輔助提取。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 設(shè)定料液比為1∶25 (g/mL)，微波功率為406 W，微波時(shí)間為4 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，固定其他條件，分別考察料液比、微波功率、微波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 辣木葉總黃酮含量測(cè)定 移取提取液1.0 mL，測(cè)定510 nm處吸光度，重復(fù)3次，按式(1)計(jì)算總黃酮含量。

(1)

式中：

X——辣木葉總黃酮提取率，%；

C——總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——定容體積，mL；

V2——顯色反應(yīng)時(shí)定容體積，mL；

m——辣木粉質(zhì)量，g；

V0——吸取提取液體積，mL。

1.3.6 抑菌活性測(cè)定 參照楊麗華等[26]的方法。

1.3.7 抗氧化活性測(cè)定

(1) DPPH·清除能力：參照楊麗華等[26]的方法。

(2) ABTS+·清除能力：參照岳秀潔等[17]的方法。

(3) ·OH清除能力：參照王娟等[27]的方法。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 各試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行單因素方差分析和IC50值計(jì)算，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件分析響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

由圖1可知，隨著料液比、微波功率、微波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，辣木葉總黃酮提取率均呈先升高后降低的趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著料液比的增加，辣木葉粉末與溶劑的接觸更充分，總黃酮提取率逐漸提高，但料液比增大到一定程度后，總黃酮已基本溶出，再增加料液比會(huì)導(dǎo)致其他可溶性雜質(zhì)與黃酮類化合物競爭溶劑，導(dǎo)致提取率下降[17，28]。微波功率較低、微波時(shí)間過短時(shí)，總黃酮溶出不完全，反之則會(huì)破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)[28-29]。乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加會(huì)造成溶劑的極性下降，乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)會(huì)導(dǎo)致水溶性物質(zhì)溶出，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致脂溶性成分溶出，從而降低辣木葉總黃酮提取率[30]。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比、微波功率、微波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)為因素，以辣木葉總黃酮提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，各因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

采用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行分析，得到辣木葉總黃酮提取率與各因素的回歸方程模型為：

Y=7.32-0.23A-0.046B-0.073C-0.045D+0.071AB+4.250E-003AC-0.09AD+4.656E-003BC-3.938E-004BD+0.052CD-0.20A2-0.22B2-0.099C2-0.34D2。

(2)

由表3可知，模型P<0.000 1，極顯著，失擬項(xiàng)P=0.534 4>0.05，不顯著，表明所得回歸方程擬合較好，回歸性顯著。模型中A、C、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(P<0.01)，B、D、AD對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(P<0.05)。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響從大到小依次為料液比>微波時(shí)間>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析?

根據(jù)響應(yīng)面分析得到最佳工藝條件為料液比1∶28.84 (g/mL)、微波功率521.88 W、微波時(shí)間3.61 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)49.86%，此條件下辣木葉總黃酮提取率預(yù)測(cè)值為7.411%。為了便于操作，將最佳提取工藝調(diào)整為料液比1∶29 (g/mL)、微波功率567 W、微波時(shí)間3.6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，此條件下辣木葉總黃酮實(shí)測(cè)提取率為(7.414±0.027)%，與理論值接近，說明模型擬合良好，工藝合理可行。

研究[31-33]表明，辣木葉中的營養(yǎng)成分含量與品種、產(chǎn)地、采收時(shí)期和樣品干燥方式等密切相關(guān)，試驗(yàn)中辣木葉總黃酮的提取率高于前人[10,12-13,15-20,22]，可能與辣木葉的產(chǎn)地、干燥方式、采收時(shí)期和提取條件等有關(guān)。

2.3 抑菌活性

抑菌圈直徑大小可以反映供試菌種對(duì)總黃酮的敏感程度，參照藿歸國等[34]的方法可劃分為高度敏感(直徑>20 mm)、敏感(直徑14～20 mm)、中度敏感(直徑8～14 mm)和不敏感(直徑<8 mm[30])。由表4可知，辣木葉總黃酮對(duì)3種供試菌種的抑菌活性有顯著差異(P<0.05)，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌對(duì)辣木葉總黃酮中度敏感，金黃色葡萄球菌對(duì)辣木葉總黃酮不敏感。辣木葉總黃酮提取液對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳，抑菌圈直徑為(10.64±0.04) mm，顯著高于大腸桿菌，對(duì)金黃色葡萄球菌基本無抑制效果。

表4 辣木葉總黃酮的抑菌圈直徑?

研究[35]表明，黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抑菌活性，如槲皮素-3-O-葡糖苷及各種槲皮素苷、山奈酚及其衍生物、芹菜素、兒茶素等具有抑菌作用，這些化合物已在辣木葉總黃酮中被鑒定出[9-11]。王麗虹等[23]研究表明，辣木葉醇提物及其乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有不同程度的抑制作用。郭妍等[11]研究表明，5～500 μg/mL的辣木葉黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，對(duì)大腸桿菌無抑制效果。馬金魁等[14]研究表明，辣木葉總黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有較好的抑制效果，抑菌圈直徑分別為(17.30±0.01)，(16.20±0.10)，(12.50±0.10)mm。王遠(yuǎn)[10]研究表明辣木葉總黃酮的抑菌效果受到純化與否及辣木葉總黃酮質(zhì)量濃度的影響。以上結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果有差異，可能與辣木葉總黃酮溶液的質(zhì)量濃度以及黃酮類單體成分的組成不同有關(guān)。

2.4 抗氧化活性

由圖2可知，隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，DPPH·和ABTS+·的清除率逐漸上升，但均低于相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.02～0.10 mg/mL時(shí)，隨著辣木葉總黃酮質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)·OH的清除率幾乎呈線性上升。當(dāng)辣木葉總黃酮質(zhì)量濃度為0.02～0.06 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率低于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，當(dāng)辣木葉總黃酮質(zhì)量濃度>0.08 mg/mL時(shí)，其對(duì)·OH的清除率高于抗壞血酸，說明高濃度的提取物對(duì)·OH的清除效果較好。抗壞血酸對(duì)DPPH·、 ABTS+·和·OH的IC50值分別為0.007，0.001，0.047 mg/mL，而辣木葉總黃酮對(duì)應(yīng)的IC50值分別為0.024，0.014，0.051 mg/mL，分別為抗壞血酸的3.43，14.00，1.09倍。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

通過Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，得到微波輔助提取辣木葉總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶29 (g/mL)、微波功率567 W、微波時(shí)間3.6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，此條件下辣木葉總黃酮提取率為(7.414±0.027)%。與傳統(tǒng)的溶劑浸提相比，試驗(yàn)方法具有提取時(shí)間短、提取率高的特點(diǎn)。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉總黃酮對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有不同程度的抑菌作用，屬于中度敏感，對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎無抑制作用。抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，辣木葉總黃酮對(duì)體外DPPH·、·OH、ABTS+·清除的半抑制濃度分別為0.024，0.051，0.014 mg/mL，說明其具有較強(qiáng)的抗氧化活性。試驗(yàn)所選取的供試菌種和抗氧化方法較少，對(duì)辣木葉總黃酮的抑菌和抗氧化活性評(píng)價(jià)還不夠全面，后續(xù)應(yīng)選用更多的菌種和不同原理的抗氧化方法進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)抑菌和抗氧化活性的機(jī)理進(jìn)行探索。此外，不同的黃酮類化合物單體的抑菌和抗氧化能力不同，多種黃酮類化合物單體聯(lián)用會(huì)形成協(xié)同或拮抗作用。試驗(yàn)中的辣木葉總黃酮為粗提物，具體的黃酮類單體成分及含量尚不明確，還需進(jìn)一步研究。