基于核因子-κB信號通路分析補腎活血祛濕中藥治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制

莫志生, 徐培青, 李桓宇, 滑國田, 程戴維, 扈自然

[北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院(龍崗) 骨傷一科, 廣東 深圳, 518100]

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，全球有超過2.5億人群受累。人群流行病學研究[1]顯示, KOA患者的病死率較健康人群高55%。KOA的危險因素包括半月板切除、肥胖、體力勞動和膝外傷。微小RNA(miRNA)無編碼能力，含有約20個核苷酸，具有調(diào)節(jié)某些靶基因的能力[2-3]。微小RNA-26a(miR-26a)與多種人類疾病有關(guān)，包括乳腺癌、肺動脈高壓和多發(fā)性硬化癥。研究[4]表明miR-26a 參與了KOA的發(fā)生和發(fā)展。研究[5]顯示, toll樣受體4(TLR4)是toll樣受體(TLRs)成員之一，核因子-κB(NF-κB)則是常見的轉(zhuǎn)錄因子，與免疫和炎癥有關(guān)。有研究[6-7]揭示了TLR4/NF-κB信號通路與KOA有關(guān)。然而, miR-26a/TLR4/NF-κB信號通路與KOA的關(guān)系尚未得到證實。中醫(yī)認為KOA病因是肝腎虧損、氣血不足致筋骨失養(yǎng)而拘急，又有慢性損傷、風寒濕邪內(nèi)侵，導致脈絡(luò)不通、氣血瘀滯，故治以補腎壯骨、化瘀通絡(luò)兼祛寒除濕為主[8]。補腎活血祛濕的中藥主要有黃芩、巴戟天、生地黃、熟地等，臨床研究[9]顯示補腎活血祛濕中藥治療KOA的有效率可達93.5%。本研究基于miR-26a/TLR4/NF-κB信號通路探討補腎活血祛濕中藥治療KOA的效果及作用機制，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)

清潔級SD(Sprague-Dawley)大鼠100只，26周齡，體質(zhì)量(180±20) g, 由昆明醫(yī)科大學動物試驗中心提供[許可證號: SCXK(云)2019-0052; 合格證號: SCXK(渝)2020-0015]。將大鼠隨機分為5組，即正常對照組、模型對照組、地塞米松組(天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號20201455, 給藥劑量50 mg/kg)、補腎活血祛濕中藥低劑量組(簡稱中藥低劑量組，給藥劑量50 mg/kg, 組方包括黃芩、巴戟天、生地黃、熟地各20 g, 薏苡仁12 g, 枸杞、澤瀉、紅花各10 g, 沙參、紫丹參、羌活各15 g)、補腎活血祛濕中藥高劑量組(簡稱中藥高劑量組，給藥劑量100 mg/kg), 每組20只，雌雄各半。所有動物手術(shù)均已獲得本院生物倫理委員會批準，并按照美國國立衛(wèi)生研究院有關(guān)處理和護理實驗動物的指南標準進行。

1.2 大鼠模型制備

模型對照組、地塞米松組、中藥低劑量組及高劑量組大鼠采用前交叉韌帶橫斷術(shù)(ACLT)建立KOA模型。術(shù)前稱重，給予大鼠0.1 mL/kg的戊巴比妥納腹腔麻醉，仰臥置于手術(shù)臺上，右觸髕骨，在距髕骨內(nèi)側(cè)5 mm處縱向切開，直至暴露膝關(guān)節(jié)腔; 行髕骨脫位屈膝，前交叉韌帶切斷，內(nèi)側(cè)半月板切除，閉合關(guān)節(jié)腔，層層縫合切口，然后分層縫合，待完全清醒后關(guān)籠飼養(yǎng)。當大鼠縮爪熱潛伏期(PWTL)明顯縮短、Mankin′s評分明顯升高時，說明膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立成功。正常對照組大鼠不給予任何操作; 地塞米松組、中藥低劑量組及高劑量組在造模成功第1天開始給予相應劑量的藥物灌胃(灌胃體積為20 mL/kg), 持續(xù)給予4周; 正常對照組和模型對照組給予等體積生理鹽水。

1.3 大鼠處死及樣本采集

試驗結(jié)束后，在40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉(腹腔注射)下心臟取血10 mL, 分離血清，隨后采用頸椎斷頭術(shù)對大鼠實施安樂死。取出大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，并固定在10%福爾馬林中進行組織學分析。將部分關(guān)節(jié)組織在PBS中勻漿(10%), 用于生化和分子生物分析。

1.4 大鼠PWTL的測定

試驗結(jié)束后，采用Ugo Basile熱痛測試儀測定大鼠PWTL。將大鼠置于玻璃底的試驗室中并適應環(huán)境15 min; 調(diào)節(jié)測試儀紅外輻射探頭的強度，使其對大鼠的刺激能力維持在10 s左右，切割時間設(shè)為25 s。行為升高或跛行的大鼠被判定為陽性，產(chǎn)生陽性反應的最短時間是PWTL。每只大鼠測試3次，每次間隔5 min。

1.5 大鼠Mankin′s評分的測定

由2名獨立觀察者根據(jù)改良的Mankin′s評分標準對膝關(guān)節(jié)軟骨病變的程度進行評分。評分范圍為0～14分，評分越高表示膝關(guān)節(jié)退變越嚴重。

1.6 大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理學檢測

膝關(guān)節(jié)滑膜組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋, 4 μm切片。依次在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中脫蠟10 min; 脫蠟后的組織依次用無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇和70%乙醇浸泡2 min, PBS漂洗2次, 5 min/次。采用蘇木精染色3 min, 自來水沖洗3 min, 1%鹽酸顯色2 s, 自來水沖洗2 min, 依次在50%、70%、80%的乙醇中浸泡2 min, 伊紅中浸泡5 s, 自來水沖洗3 min, 將組織切片依次浸泡在90%乙醇、無水乙醇Ⅱ、無水乙醇Ⅱ中3 min, 然后依次浸泡在二甲苯中Ⅰ和二甲苯Ⅱ中5 min; 采用中性樹脂密封并進行顯微鏡檢查。

1.7 血清白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-1b(IL-1b)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平的測定

采用IL-4、IL-1b、TNF-α ELISA試劑盒(研域上海化學試劑有限公司，批號為415548、541214、6598218)測定IL-4、IL-1b、TNF-α水平。采集麻醉大鼠股動脈動脈血10 mL, 離心收集血清標本，分裝于無菌Eppendorf(EP)管中。根據(jù)IL-4、IL-1b、TNF-α ELISA試劑盒制備8個標準物質(zhì)，第8孔為空白對照組。將標準物質(zhì)和樣品(100 μL)分別加入96孔板中, 37 ℃孵育2 h, 加入100 μL一抗，孵育1 h; 每孔加入100 μL二抗，然后每孔再加入100 μL顯色試劑，孵育30 min; 每孔加入50 μL終止液終止反應。測定各孔的吸光度值和濃度，繪制標準曲線。

1.8 miR-26a、NF-κB、TRL4在膝關(guān)節(jié)滑膜組織中表達的測定

采用Trizol試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 批號為GH-521 459.3)從膝關(guān)節(jié)滑膜組織中提取總RNA。miR-26a、NF-κB、TRL4引物由Takara Biotechnology Co.,Ltd. (日本大阪)設(shè)計。miR-26a、NF-κB、TRL4序列為: ① miR-26a正向為5′-TCGGGATCGATCGTAGTCGATCGATCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGTCCC-3′, 反向為5′-TGGGTCGATGCTAGCTAGCTGATCGATCGATCGTAGCTAGTCAGTCGATCGCTGCTA-3′。②NF-κB正向為5′-TGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTA-3′, 反向為5′-TGGGGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTATCATCAGTCAGTCATCATCTGCC-3′。③TRL4正向為5′-TGCGATCGATCGACTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTACGATCGATCGC-3′, 反向為5′-TGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATGCTA-3′。④β-actin正向為5′-TGGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCGGCGATGCTAGCTAGCTAGCTAGCT-3′, 反向為5′-TGGGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTGCTAGTCGATCGATCGATCGATGCTGA-3′。使用PrimeScript RT試劑盒(寶生物科技有限公司，中國，批號為XD4158 748.32)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(寶生物科技有限公司，中國，批號為HU-587485)的說明，使用ABIPRISM?7300系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA, 批號為BG-5489596)對反應液進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。環(huán)境條件為: 具有初始變性10 min的熱循環(huán)曲線，在95 ℃、95 ℃下20 s、60 ℃下30 s、72 ℃下20 s進行40個循環(huán)。β-actin作為miR-26a、NF-κB、TRL4相對表達的內(nèi)參, mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平用2-△△Ct法計算。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法測定大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB、TRL4蛋白水平

使用蛋白質(zhì)裂解緩沖液(RIPA, 中國碧云天生物科技，批號為54985485)裂解膝關(guān)節(jié)滑膜組織，使用微二辛可寧酸蛋白質(zhì)測定試劑盒(中國碧云天生物科技，批號為20153655)調(diào)節(jié)每個樣品的蛋白質(zhì)濃度。將樣品和上樣緩沖液混合并在100 ℃下煮沸5 min，蛋白質(zhì)(40 μg)在10%丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE, 美國賽默飛世，批號為#548985)上電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(德國默克生物科技，批號為SD-51488)上，用5%脫脂奶粉在4 ℃下密封過夜。蛋白質(zhì)加入一抗: TLR4(Abcam, Cambridge, UK, 2 μg/mL, 批號為2148745), NF-κB(以1∶1 000比例稀釋, Cell Signaling Technology, MA, USA, 批號為CV-56248)、β-肌動蛋白(以 1∶1 000稀釋，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz, CA, USA, 批號為4154785), 培養(yǎng)過夜并用PBS洗3次, 5 min/次。蛋白加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(1∶1 000, 湖北武漢博斯特生物科技有限公司，批號為YU-514785), 37 ℃孵育1 h。將膜浸入增強型化學發(fā)光(ECL)反應試劑(Pierce, Rockford, IL, USA, PIH為102365)中1 min。曝光、顯影、定影后觀察結(jié)果。以β-actin為內(nèi)參，蛋白標記購自Piercenet(德國默克生物科技，批號為#854785), Western Blot蛋白印記圖像通過ImageJ2x軟件(National Institutes of Health, MD, USA)進行分析。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行錄入及統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用LSD-t兩兩檢驗，檢驗水準α為0.05,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠PWTL、Mankin′s評分比較

與正常對照組比較，模型對照組PWTL縮短, Mankin′s評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與模型對照組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、地塞米松組PWTL延長, 地塞米松組、中藥高劑量組Mankin′s評分降低，且中藥高劑量組PWTL長于中藥低劑量組, Mankin′s評分低于中藥低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥低劑量組PWTL縮短, Mankin′s評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥高劑量組PWTL縮短, Mankin′s評分升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠PWTL、Mankin′s評分比較

2.2 各組大鼠血清IL-4、IL-1b、TNF-α水平比較

與正常對照組比較，模型對照組血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與模型對照組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、地塞米松組血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平降低，且中藥高劑量組血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平低于中藥低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥低劑量組血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥高劑量組血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平輕微升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清IL-4、IL-1b、TNF-α水平比較 mmol/mL

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)比較

正常對照組膝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)正常，軟骨細胞圓潤，排列均勻整齊; 模型對照組關(guān)節(jié)面凹凸不平，多毛刺，滑膜表面凹凸不齊，軟骨細胞增殖，排列變厚，可見明顯中性粒細胞浸潤; 應用地塞米松及補腎活血祛濕中藥干預后，滑膜結(jié)構(gòu)趨于平整，中性粒細胞浸潤減少，結(jié)構(gòu)趨于正常。見圖1。

A: 正常對照組; B: 模型對照組; C: 地塞米松組; D: 中藥低劑量組; E: 中藥高劑量組。圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織結(jié)構(gòu)的HE染色結(jié)果(放大倍數(shù)400倍)

2.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織miR-26a mRNA、NF-κB mRNA、TRL4 mRNA表達比較

與正常對照組比較，模型對照組miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平升高(P<0.05); 與模型對照組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、地塞米松組miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平降低，且中藥高劑量組miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平低于中藥低劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥低劑量組miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥高劑量組miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平輕微升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織miR-26a mRNA、NF-κB mRNA、TRL4 mRNA表達比較

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB、TRL4蛋白表達水平比較

與正常對照組比較，模型對照組NF-κB、TRL4蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與模型對照組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、地塞米松組NF-κB、TRL4蛋白表達水平降低，且中藥高劑量組NF-κB、TRL4蛋白表達水平低于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥低劑量組NF-κB、TRL4蛋白表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與地塞米松組比較，中藥高劑量組NF-κB、TRL4蛋白表達水平輕微升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB、TRL4蛋白表達水平比較

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織NF-κB、TRL4蛋白表達水平比較

3 討 論

KOA是世界范圍內(nèi)最常見的關(guān)節(jié)炎類型，是導致老年人疼痛和殘疾的主要原因。KOA累及髖、膝等負重關(guān)節(jié)，可導致關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進行性加重和愈合反應不足。KOA的特征是滑膜關(guān)節(jié)中關(guān)節(jié)軟骨的丟失、損傷以及炎癥反應，多種炎癥因子在KOA的發(fā)病機制中起重要作用。白細胞介素-1(IL-1)被認為是炎癥調(diào)節(jié)的起始因子，可以被模式識別受體(PRRs)識別而參與級聯(lián)放大的炎癥效應。IL-1b 是 IL-1 家族的主要成員，已被證明在 KOA 的進展中起重要作用[10]。在KOA患者的關(guān)節(jié)液中可檢測到大量 IL-1b, 在KOA患者的軟骨組織中也發(fā)現(xiàn)了IL-1b的高表達，組織中IL-1b的水平則直接反映了KOA的嚴重程度[11]。本研究中，與正常對照組比較，模型對照組PWTL縮短, Mankin′s評分、血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 病理學結(jié)果顯示模型對照組關(guān)節(jié)面凹凸不平，多毛刺，滑膜表面凹凸不齊，軟骨細胞增殖，排列變厚，可見明顯的中性粒細胞浸潤，這說明KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織存在損傷及嚴重的炎癥反應，建模成功。

中醫(yī)[12]認為KOA病因為肝腎不足，表現(xiàn)為腰膝酸軟、骨節(jié)疼痛、屈伸不利、筋肉萎縮、肢體麻木、遇勞加重、反復發(fā)作，且伴有面色少華、形寒肢冷，或頭暈耳鳴、筋脈拘急，舌淡苔白或舌紅少苔，脈沉弱或沉數(shù)。補腎活血祛濕中藥可滋補腎臟、填精補腎、健壯骨筋、活血通絡(luò)、搜風祛邪止疼，治療KOA的效果顯著[13]; 此外，補腎活血祛濕中藥對神經(jīng)性疼痛和慢性炎癥性疼痛也具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，但其機制尚未明確。本研究中，與模型對照組比較，中藥低劑量組、中藥高劑量組、地塞米松組PWTL延長，血清IL-1b、IL-4、TNF-α水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 應用地塞米松及補腎活血祛濕中藥干預后，滑膜結(jié)構(gòu)趨于正常，中性粒細胞浸潤減少，這說明補腎活血祛濕中藥能顯著抑制KOA炎癥反應。

miRNA是一類小的、非蛋白質(zhì)編碼的RNA, 作為基因調(diào)節(jié)因子，控制靶基因和多種生物途徑。miR-26a位于CTDSPL基因的非編碼區(qū)，通過靶向基因的mRNA和介導免疫信號來調(diào)節(jié)炎癥反應、癌癥發(fā)病機制和癌癥發(fā)展。研究[14]證明，上調(diào)的miR-26a、miR-26b表達可通過促進p65易位而導致KOA的發(fā)病。研究[15]表明, KOA患者hsa-circ-0005105的上調(diào)可以通過調(diào)節(jié)miR-26a促進軟骨細胞細胞外基質(zhì)的降解。上述研究表明miR-26a在KOA中起重要作用。NF-κB被認為是調(diào)節(jié)炎癥產(chǎn)生的分子開關(guān)，是近年來炎癥免疫研究領(lǐng)域的熱點。NF-κB的激活導致caspase-1的裂解[16], 活化的caspase-1能夠切割和加工pro-IL-1b和IL-18, 以促進其切割為成熟的IL-1b和IL-18并分泌細胞，這些細胞因子進一步參與炎癥級聯(lián)反應的調(diào)節(jié)。NF-κB已被證明在包括骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種疾病的炎癥反應中發(fā)揮重要作用[17], 并提出抑制NF-κB可以改善糖尿病腎病的腎功能障礙。研究[18]表明抑制NF-κB激活可以逆轉(zhuǎn)肝臟炎癥并改善肝纖維化; 此外，抑制NF-κB激活可以改善骨關(guān)節(jié)炎的內(nèi)側(cè)半月板(DMM)模型不穩(wěn)定的骨關(guān)節(jié)炎疾病進展。因此，作為炎癥反應的核心, NF-κB炎癥小體可能為治療KOA提供新的靶點。一項研究[19]表明, miR-26a過表達會促進心臟纖維化中的NF-κB活性，通過抑制miR-26a來滅活NF-κB可抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生。因此，干擾miR-26a而調(diào)控NF-κB信號通路的靶向策略可以為KOA的治療提供新的潛在的治療選擇。

本研究結(jié)果顯示，補腎活血祛濕中藥可抑制miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平，進而抑制miR-26a/NF-κB/TRL4通路的激活。研究[20]表明, miR-26a的高表達水平與肥胖小鼠模型中軟骨細胞的慢性炎癥增加有關(guān)，下調(diào)miR-26a表達則減弱了關(guān)節(jié)軟骨細胞中NF-κB的激活和促炎細胞因子的分泌。基于RT-PCR結(jié)果、蛋白質(zhì)印跡分析，在KOA大鼠的滑膜組織中發(fā)現(xiàn)NF-κB水平增加，表明NF-κB信號通路存在異常激活; NF-κB信號通路激活后可觸發(fā)TRL4基因的蛋白表達，誘導關(guān)節(jié)破壞，導致KOA的發(fā)生和進展。當NF-κB 依賴基因基于Sirtuin 6的過度表達而耗盡時, KOA的發(fā)展會通過減少炎癥反應和軟骨細胞的衰老而受到抑制。此外，通過抑制NF-κB信號通路，胸腺醌抑制了IL-1β誘導的KOA軟骨細胞炎癥?；こ衫w維細胞中NF-κB信號通路的高激活導致大部分與類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的滑膜炎癥。血管活性腸肽作為抗炎和抗風濕劑，通過下調(diào)NF-κB的活性和表達來改善膠原誘導性關(guān)節(jié)炎大鼠的滑膜細胞功能。

綜上所述，補腎活血祛濕中藥能顯著抑制KOA炎癥反應，其機制可能與補腎活血祛濕中藥抑制miR-26a mRNA、NF-κBmRNA、TRL4mRNA表達水平以及抑制miR-26a/NF-κB/TRL4通路的激活有關(guān)。