秋水仙素誘導(dǎo)“法新”藍(lán)莓多倍體初探

崇慧影，安常蓉，王代波，文光琴，趙亮清*

（1.貴州省生物研究所，貴州貴陽(yáng) 550009；2.貴州省植物園，貴州貴陽(yáng) 550004）

藍(lán)莓（Vaccinium uliginosum）為杜鵑花科越橘屬植物，又名藍(lán)漿果，是一種多年生灌木，其果實(shí)富含多種維生素、微量元素及花色素苷、類黃酮等生理活性成分，這些化合物對(duì)人體有多種益處，如清除體內(nèi)多余自由基、提高免疫力、抵抗身體和皮膚的氧化衰老等[1]。藍(lán)莓作為果中珍品，因保健及藥用價(jià)值較高，已被聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織列為人類五大健康食品之一[2]。目前，我國(guó)具有較豐富的野生藍(lán)莓資源，但野生品種產(chǎn)量低且品質(zhì)差，而多倍體藍(lán)莓不僅枝繁葉茂、抗性強(qiáng)，而且果實(shí)品質(zhì)好、果大、產(chǎn)量高，為選育優(yōu)質(zhì)新品種提供了重要途徑，對(duì)開發(fā)利用及保存我國(guó)藍(lán)莓種質(zhì)資源具有重大意義[3]。

與普通的二倍體植物相比，多倍體植物在遺傳可塑性及生理適應(yīng)性等方面具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，因此越來(lái)越多的植物學(xué)家熱衷于探究多倍體的選育工作。隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展及科學(xué)研究的不斷深入，植物多倍體誘導(dǎo)也愈發(fā)得到廣泛的應(yīng)用及發(fā)展[4]。誘導(dǎo)多倍體通常采用3 種方法，即生物學(xué)方法、物理方法及化學(xué)方法，最常用的方法是采用化學(xué)誘變劑進(jìn)行誘導(dǎo)，這也是當(dāng)前最有效、最經(jīng)濟(jì)的方式[5]。在多倍體誘導(dǎo)過(guò)程中，通常選取植物體內(nèi)生長(zhǎng)最活躍、最旺盛的組織器官進(jìn)行誘導(dǎo)，如植株的愈傷組織、萌動(dòng)或剛出芽的種子幼苗、幼嫩枝條的生長(zhǎng)點(diǎn)等，采用吲哚乙酸、秋水仙素等化學(xué)誘變劑對(duì)其進(jìn)行處理，均可誘導(dǎo)形成多倍體，該方法最大的優(yōu)勢(shì)就是具有高度專一性[6]。在所有的誘變劑中，秋水仙素處理誘變效果最佳。用秋水仙素處理細(xì)胞后，由于紡錘絲不能形成而停留在有絲分裂中期階段，每一個(gè)染色體形成的一對(duì)染色單體分離，但由于缺少紡錘絲的牽引而不能向兩極移動(dòng)，無(wú)法形成兩個(gè)單獨(dú)的子細(xì)胞，最終導(dǎo)致染色體加倍[7]。有學(xué)者使用秋水仙素對(duì)蘋果組培苗幼葉片進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)增添了濃度為2%的二甲基亞砜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用濃度為0.5%的秋水仙素對(duì)其處理4 d 后，有56.1%的植株被誘導(dǎo)成多倍體[8]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)與秋水仙素誘導(dǎo)多倍體相結(jié)合的技術(shù)選育新品種，比常規(guī)雜交育種周期短，不受季節(jié)變化的影響，能較快繁育出藍(lán)莓多倍體新品種，不僅提高了藍(lán)莓果實(shí)品質(zhì)，還推動(dòng)了藍(lán)莓工廠化育苗。

因此，本試驗(yàn)以“法新”藍(lán)莓組培苗為研究對(duì)象，通過(guò)觀察植株的生長(zhǎng)特征及測(cè)定植株的各項(xiàng)生理指標(biāo)，探究不同濃度秋水仙素和不同浸泡時(shí)間對(duì)藍(lán)莓組培苗的影響，以期篩選出藍(lán)莓多倍體誘導(dǎo)的最佳處理濃度和時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為“法新”藍(lán)莓組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多倍體誘導(dǎo)

選取生長(zhǎng)健壯的藍(lán)莓無(wú)菌組培苗，剪取長(zhǎng)度約1 cm的莖段。選取生長(zhǎng)一致的莖段浸泡在3 種不同濃度（0.1%、0.2%、0.4%）的秋水仙素溶液中，浸泡時(shí)間分別為10 h、18 h、26 h，共9個(gè)處理，每個(gè)處理30個(gè)莖段；將秋水仙素浸泡過(guò)的莖段置于搖床（120 r·min-1）振蕩，處理溫度為(26±1)℃；將處理好的莖段接種于改良的WPM 培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種6 瓶，每瓶接種5 個(gè)莖段。同時(shí)在改良的WPM 培養(yǎng)基上接種未經(jīng)秋水仙素處理的莖段作為對(duì)照。

培養(yǎng)條件：改良WPM培養(yǎng)基的pH值為5.6，培養(yǎng)室相對(duì)濕度為(75±5)%，溫度為(25±1)℃，光照周期為12 h·d-1，光照強(qiáng)度為1 800～2 500 lx，各處理因素水平組合列于表1。

表1 秋水仙素濃度及時(shí)間處理組合

1.2.2 測(cè)量指標(biāo)及方法

1）生長(zhǎng)指標(biāo)。繼代培養(yǎng)45 d 后，根據(jù)形態(tài)觀察法確定成活植株和變異植株，統(tǒng)計(jì)不同處理的成活數(shù)和變異數(shù)，計(jì)算成活率和變異率，計(jì)算公式為[9]：

成活率=成活株數(shù)/總處理株數(shù)×100%

變異率=變異株數(shù)/總處理株數(shù)×100%

2）形態(tài)指標(biāo)。對(duì)藍(lán)莓植株的株高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片數(shù)、莖粗、鮮質(zhì)量和增殖數(shù)進(jìn)行測(cè)定，數(shù)據(jù)以xˉ±s表示。

3）綜合性評(píng)價(jià)。采用SPSS 軟件計(jì)算半致死時(shí)間（LT50），采用隸屬函數(shù)法對(duì)其綜合性評(píng)價(jià)[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對(duì)藍(lán)莓組培苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.1.1 成活率

由表2 可知，藍(lán)莓組培苗的成活率受到秋水仙素濃度和處理時(shí)間的雙重影響。對(duì)照組藍(lán)莓組培苗成活率最高，達(dá)100%；秋水仙素濃度一致時(shí)，各處理間成活率大小排序?yàn)锳1＞A2＞A3，B1＞B2＞B3，C1＞C2＞C3，表明藍(lán)莓組培苗的成活率隨著秋水仙素處理時(shí)間的增加而減??；秋水仙素作用時(shí)間相同時(shí)，成活率大小排序?yàn)锳1＞B1＞C1，A2＞B2＞C2，A3＞B3＞C3，表明秋水仙素處理濃度越高，藍(lán)莓苗成活率越低。

2.1.2 變異率

由表2可知，藍(lán)莓苗變異率排序?yàn)锽1＞B2＞C3＞B3＞A2＞A3＞C1＞C2＞A1，B1 處理和B2 處理的變異率分別為35.7%和29.6%。當(dāng)秋水仙素處理濃度為0.1%時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，變異率變化趨勢(shì)為先升后降，最高達(dá)21.4%；濃度為0.2%時(shí)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，變異率逐漸降低，最高為35.7%；濃度為0.4%時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，變異率先降后升，最高為25.0%。在處理時(shí)間為10 h、18 h 時(shí)，隨著處理濃度的增加，變異率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)；在處理時(shí)間為26 h時(shí)，變異率隨濃度的增加而增大。

表2 不同秋水仙素處理對(duì)藍(lán)莓組培苗成活率和變異率的影響

2.2 秋水仙素對(duì)藍(lán)莓組培苗形態(tài)指標(biāo)的影響

由表3 可知，不同秋水仙素處理下藍(lán)莓組培苗形態(tài)指標(biāo)差異顯著。1）株高排序?yàn)锳3＞C2＞A1＞B1＞C3＞CK＞B3＞C1＞B2＞A2，A3 處理平均株高最高，為47.84 mm，比對(duì)照高4.49 mm；A1、B1、C2、C3與A3 處理間差異不顯著（P＞0.05），A2、B2、B3、C1、CK 與A3 處理間差異顯著（P＜0.05）。2）葉長(zhǎng)排序?yàn)镃1＞A3＞B1＞C2＞B3＞C3＞A1＞A2＞B2＞CK，C1處理葉長(zhǎng)最長(zhǎng)，為10.40 mm，比對(duì)照長(zhǎng)2.48 mm；A3、B1、B3、C2與C1處理間差異不顯著（P＞0.05），A1、A2、B2、C3、CK 與C1 處理間差異顯著（P＜0.05），B2、CK 處理葉長(zhǎng)最短，且二者間差異不顯著（P＞0.05）。3）C1 處理葉寬值最大（6.20 mm），CK 葉寬值最?。?.06 mm），兩者相差2.14 mm；各處理葉寬排序?yàn)镃1＞B1＞A2＞B3＞A3＞C3＞C2＞B2＞A1＞CK，但C1與B1處理間差異不顯著（P＞0.05）。4）葉片數(shù)最多的為A1（14.65 片），各處理具體排序?yàn)锳1＞A3＞C2＞C3=B2＞CK＞B1＞B3＞A2＞C1，但A3、B2、C2、C3、CK 與A1 處理間差異不顯著（P＞0.05）。5）A3 處理莖段最粗（1.08 mm），CK莖段最細(xì)（0.71 mm），兩者相差0.37 mm；各莖段粗度排序?yàn)锳3＞A2＞B3＞C1＞C2＞A1＞B2＞C3＞B1＞CK，但A3 與A2、B3、C1 處理間差異不顯著（P＞0.05）。6）A2 處理鮮質(zhì)量最大，為0.53 g，各處理鮮質(zhì)量排序?yàn)锳2＞C2＞B2＞C1＞C3＞B3＞A3=B1=CK＞A1，其中B2、C1、C2 與A2 處理差異不顯著（P＞0.05）。7）CK 處理增殖數(shù)最多，為6.8個(gè)，其次為B2 處理，增殖數(shù)為4.93 個(gè)，二者差異顯著（P＜0.05）；各處理增殖數(shù)排序?yàn)镃K＞B2＞A1＞A2＞C1＞A3＞B1＞C3＞B3＞C2。

表3 不同秋水仙素處理對(duì)藍(lán)莓組培苗形態(tài)指標(biāo)的影響

2.3 秋水仙素對(duì)藍(lán)莓組培苗各指標(biāo)隸屬度、綜合值及半致死時(shí)間的影響

由表4 可以看出，通過(guò)隸屬函數(shù)對(duì)藍(lán)莓組培苗葉長(zhǎng)、葉寬、莖粗、存活率及變異率5 項(xiàng)指標(biāo)綜合分析發(fā)現(xiàn)，效果最好的為B1 處理，即0.2%濃度的秋水仙素浸泡10 h 時(shí)，“法新”藍(lán)莓植株的變異效果達(dá)到最好。

表4 不同秋水仙素處理藍(lán)莓組培苗各指標(biāo)的隸屬度及綜合值

對(duì)表2 中秋水仙素濃度0.2%時(shí)處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行半致死時(shí)間方程的擬合，將該濃度下的處理時(shí)間及相應(yīng)的死亡率代入計(jì)算得出線性回歸方程為y=0.625x-0.116 7，R2=0.962 9。經(jīng)計(jì)算，藍(lán)莓植株在秋水仙素濃度為0.2%時(shí)的半致死時(shí)間為80.19 h，說(shuō)明秋水仙素溶液對(duì)“法新”藍(lán)莓植株毒性較弱。

3 小結(jié)與討論

秋水仙素誘導(dǎo)在多倍體育種中應(yīng)用廣泛且效果明顯[11]。本試驗(yàn)中，“法新”藍(lán)莓在0.2%秋水仙素溶液中處理10 h 時(shí)，植株死亡率6.7%，變異率35.7%，誘導(dǎo)效果最佳。

有研究表明，處理材料的死亡率與秋水仙素濃度和處理時(shí)間成正比關(guān)系[1]。本試驗(yàn)表明，同一處理濃度下，植株的死亡率隨著秋水仙素處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；同一處理時(shí)間下，植株的死亡率隨著秋水仙素濃度的增高而增大，與前人研究結(jié)果趨勢(shì)一致[12]。

秋水仙素對(duì)植株毒性的大小常用半致死時(shí)間（LT50）作為參數(shù)，在EMA 誘導(dǎo)小麥突變的研究中，半致死時(shí)間篩選適宜的處理?xiàng)l件有重要的指導(dǎo)作用[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.2%濃度的秋水仙素對(duì)“法新”藍(lán)莓植株的毒性較弱，該結(jié)果與前人針對(duì)越橘屬植物的研究結(jié)果不一致，推測(cè)可能與植物品種有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)黃心獼猴桃進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)時(shí)出現(xiàn)葉片顏色加深、葉片增厚的現(xiàn)象；誘導(dǎo)黃瓜獲得四倍體時(shí)，植株出現(xiàn)莖段明顯增粗等特征[14-15]。本試驗(yàn)中，經(jīng)秋水仙素處理后的藍(lán)莓組培苗在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)葉片顏色變深、葉表皮毛增多、葉面積顯著增大、莖段明顯增粗及增殖系數(shù)減小等現(xiàn)象，各項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)與對(duì)照差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下一步將對(duì)獲得的多倍體植株煉苗移栽，觀察其田間性狀表現(xiàn)。