高通量測序技術(shù)在植物病毒分類中的應(yīng)用

劉青， 周書玉， 崔冬麗， HESLOP HARRISON John Seymour

1. 中國科學(xué)院 植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國科學(xué)院 華南植物園， 廣州 510650；2. 中國科學(xué)院 核心植物園， 廣州 510650； 3. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049；4. 萊斯特大學(xué) 遺傳學(xué)和基因組生物學(xué)系， 英國萊斯特 LE1 7RH

病毒粒子是一種由核酸和蛋白質(zhì)外殼組成的細(xì)胞內(nèi)寄生病原物， 具有生長、 遺傳和變異等生物特性和侵染活性[1]． 植物病毒寄生引起植物病毒病， 被人們稱為“植物癌癥”． 國際病毒分類委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)第10次病毒分類報(bào)告(2017年第10版)中， 病毒分類系統(tǒng)包括9目、 131科、 46亞科、 802屬和4 853種， 其中侵染植物的病毒有5目、 28科、 5亞科、 121屬、 1 440種， 與ICTV第9次病毒分類報(bào)告相比， 病毒種類增加了3目、 44科、 27亞科、 453屬、 2 569種[2]． 通過宏基因組測序獲得豐富的基因組信息， 并運(yùn)用到病毒分類和命名， 該技術(shù)獲得ICTV的認(rèn)可． 2017版病毒分類系統(tǒng)中病毒數(shù)量倍增的根本原因， 在于大范圍取樣和宏基因組測序的應(yīng)用[3]． 宏基因組測序則是利用HTS技術(shù)直接對環(huán)境中所有微生物進(jìn)行測序， 真實(shí)客觀地檢測環(huán)境中存在的病毒， 因此， HTS技術(shù)的發(fā)展在病毒檢測和分類中發(fā)揮關(guān)鍵作用． 近年來， 蔬菜、 糧食、 果樹等均有被新病毒侵染的報(bào)道， 2020年， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《一類農(nóng)作物病蟲害名錄》中包括7種病害， 其中南方水稻黑條矮縮病的病原體為南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black-streaked dwarf virus， SRBSDV)[4]， 病害嚴(yán)重影響著作物的產(chǎn)量和品質(zhì)． 農(nóng)藥和化肥的過度使用、 全球變暖以及環(huán)境的惡化， 加劇了植物病毒的傳播和發(fā)展， 而治理植物病毒病的前提是建立有效的植物病毒檢測方法．

傳統(tǒng)的植物病毒檢測方法有： 生物學(xué)檢測法、 電子顯微鏡觀察法、 血清學(xué)檢測法和分子生物學(xué)方法[5]． 生物學(xué)檢測法借助對病毒敏感的植物來檢測病毒， 檢測速度慢， 目前應(yīng)用較少； 電鏡觀察法根據(jù)病毒形態(tài)、 大小和染病組織超微結(jié)構(gòu)等檢測病毒， 在研究病毒對寄主和環(huán)境的影響[6]、 觀察病毒形態(tài)等方面十分重要， 缺點(diǎn)是檢測設(shè)備昂貴； 血清學(xué)檢測法在植物和昆蟲病毒檢測中被廣泛應(yīng)用， 可同時(shí)檢測大量樣品， 缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求高， 如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunesorbent assay， ELISA)； 分子生物學(xué)方法采用核酸雜交來檢測病毒， 如核酸雜交技術(shù)、 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR)、 熒光定量PCR及DNA微陣列技術(shù)等， 靈敏度高， 成本也高．

HTS技術(shù)可以快速獲得植物病毒基因組序列， 結(jié)合生物信息學(xué)分析， 用于已知病毒、 新病毒和僅有裸露RNA分子的類病毒鑒定． 新病毒可以是全新的病毒種類， 也可以是已知病毒種類在新寄主、 新介體和新地理范圍的新興病毒． 自2009年Rwahnih等[7]提取葡萄總RNA作為測序模板發(fā)現(xiàn)了7個(gè)已知病毒和1個(gè)新病毒——西拉葡萄病毒1號(grapevine Syrah virus-1， GSyV-1)以來， 高通量測序被廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測， 截至2016年已發(fā)現(xiàn)100多種新的病毒和類病毒[8]， 現(xiàn)已成為植物病毒檢測的主要手段． 本文總結(jié)了高通量測序技術(shù)的發(fā)展及其在植物病毒檢測中的應(yīng)用案例， 旨在為植物病毒病防治提供依據(jù)．

1 高通量測序技術(shù)的發(fā)展

DNA測序技術(shù)經(jīng)歷了里程碑式進(jìn)展， 包括以Sanger電泳法為代表的第一代測序技術(shù)、 以短讀長高通量測序?yàn)榇淼牡诙鷾y序技術(shù)和以長讀長測序?yàn)榇淼膯畏肿訉?shí)時(shí)合成測序技術(shù)[9]．

20世紀(jì)70年代， Sanger和Coulson開發(fā)的雙脫氧終止法標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的問世． 雙脫氧終止法因避免使用有毒化學(xué)物質(zhì)和放射性同位素， 成為其后30年里的主流DNA測序方法， 并通過該方法獲得了第一個(gè)人類基因組序列[10]．

第二代測序技術(shù)相比一代測序技術(shù)有質(zhì)的飛躍， 包括雜交測序和合成測序． 雜交測序依賴特定探針序列來檢測目標(biāo)序列， 例如鑒定特定基因序列中與疾病相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性或鑒定總體染色體異常[11]； 合成測序如Roche公司454焦磷酸測序技術(shù)和美國Illumina公司Solexa測序技術(shù)． 二代測序常用Illumina平臺的MiniSeq，MiSeq，NextSeq，NovaSeq和HiSeq等測序儀， 其中HiSeqX效率較高， 每年可生產(chǎn)1 800個(gè)30倍覆蓋度的人類基因組[12]． Illumina測序平臺具有快速、 靈敏和成本低等優(yōu)勢， 是目前植物病毒檢測的主要測序平臺． Wang等[13]應(yīng)用Illumina技術(shù)檢測25個(gè)筍瓜(Cucurbitamaxima)樣品， 經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)24種植物病毒， 通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)存在西葫蘆黃花葉病毒(zucchini yellow mosaic virus， ZYMV)、 西瓜花葉病毒(watermelon mosaic virus， WMV)和黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus， CMV)混合侵染現(xiàn)象．

第三代測序技術(shù)的代表有太平洋生物科學(xué)公司(Pacific Biosciences， PacBio)的單分子實(shí)時(shí)測序和牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore Technologies， ONT)的單分子納米孔測序． PacBio測序基于邊合成邊測序的原理， 設(shè)備實(shí)時(shí)捕獲并記錄熒光信號， 轉(zhuǎn)化為單堿基信息， 獲得具有單堿基分辨率的高精度序列[14]； PacBio使用的是光信號， 可通過多次測序來提高準(zhǔn)確度， 但酶的活性決定了測序長度不會(huì)特別長[15]． ONT測序基于電信號， 挑戰(zhàn)是電信號的持續(xù)穩(wěn)定性， 且對于一條DNA分子最多測序兩次， 無法像PacBio測序一樣對同一條鏈進(jìn)行多次測序， 因此相對前者ONT測序準(zhǔn)確度低． 這兩種方法都可以捕獲DNA甲基化修飾[16]、 直接測序RNA[17]， ONT測序理論上也可以測序蛋白質(zhì)， 但蛋白的氨基酸類型多、 形成多肽后構(gòu)象復(fù)雜并且蛋白的修飾多， 因此目前還沒有重大突破[18]． 2018年， Bronzato等[19]首次報(bào)道了使用Oxford MinION測序儀檢測植物和昆蟲樣品中的植物病原體． 由于第三代測序技術(shù)對樣品核酸質(zhì)量要求高， 測序的錯(cuò)誤率和成本遠(yuǎn)高于第二代測序， 加之病毒基因組遠(yuǎn)小于動(dòng)植物基因組， 所以目前病毒基因組的測序工作主要采用第二代測序技術(shù)．

2 利用高通量測序技術(shù)檢測植物病毒的流程

2.1 病毒鑒定方法

植物病毒的遺傳保守性使某些病毒物種相對穩(wěn)定， 而變異性使得一些病毒物種高度進(jìn)化． 植物病毒基因組中核苷酸突變、 基因重組、 基因重排等導(dǎo)致的新分離物或新病毒種類， 又引起毒力、 寄主、 傳播方式等特性的變化， 從而造成新的植物病毒病害流行[20]． 目前針對植物病毒病害防治還缺乏有效藥劑， 因此病害早期的檢測和鑒定尤其重要， HTS技術(shù)已被證明是植物病毒檢測和鑒定的有效方法， 該技術(shù)不需要預(yù)知病原物的染病特征、 靶向擴(kuò)增序列及病原基因組序列， 短時(shí)間內(nèi)以低成本測定樣品基因組或轉(zhuǎn)錄組， 獲得細(xì)菌、 真菌、 病毒、 寄生蟲等的病原特征． Wang等[21]利用HTS技術(shù)發(fā)現(xiàn)一種新的侵染煙草(NicotianatabacumL.)的重組蕓薹黃化病毒(brassica yellows virus， BrYV)分離物， 命名為BrYV-NtabQJ．

HTS技術(shù)分為全基因組測序、 宏基因組測序、 轉(zhuǎn)錄組測序和小RNA測序， 基于病毒序列的生物信息學(xué)分析， 可將病毒鑒定到種甚至株系． 2017年， ICTV已允許根據(jù)基因組序列證據(jù)鑒定新病毒[3]， 根據(jù)基因組測序方法鑒定出的病毒種類， 已遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)方法鑒定的病毒數(shù)量． ICTV于2019年2月啟用域、 亞域、 界、 亞界、 門、 亞門、 綱、 亞綱、 目、 亞目、 科、 亞科、 屬、 亞屬和種的15個(gè)分類階元， 其中域、 界、 門、 綱、 目、 科、 屬、 種為主要等級， 其余為衍生等級[22]． 同時(shí)公布了不同分類階元病毒的界定標(biāo)準(zhǔn)(https： //talk.ictvonline.org/)， 以病毒全基因組核苷酸序列的同源性為依據(jù)， 進(jìn)行病毒株系或種的劃分己成為分類的一個(gè)常規(guī)手段． 在Potyviridae中， 屬的界定標(biāo)準(zhǔn)是完整開放閱讀框(open reading frame， ORF)的核苷酸同源序列小于46%， 種的界定標(biāo)準(zhǔn)為完整ORF核苷酸同源序列小于76%或氨基酸同源序列小于82%， 單個(gè)蛋白編碼區(qū)域從第一蛋白(the first protein， P1)編碼區(qū)域的58%到其他區(qū)域的74%～78%， 對于外殼蛋白(coat protein， CP)基因， 最優(yōu)的物種劃分標(biāo)準(zhǔn)是76%～77%的核苷酸和80%的氨基酸同源性[23]； 同科不同屬的物種界定標(biāo)準(zhǔn)不同， 在Geminiviridae中Begomovirus的物種界定標(biāo)準(zhǔn)是全基因組核苷酸同源序列小于91%[24]， 而Mastrevirus屬的物種界定標(biāo)準(zhǔn)是全基因組核苷酸同源序列小于78%． 周俊[25]根據(jù)Betaflexiviridae下Trichovirus的物種劃分標(biāo)準(zhǔn)， 即相關(guān)蛋白或CP之間核苷酸同源序列低于72%、 氨基酸同源序列低于80%[26]， 將分離物RP19-1，RP19-2，Ta Tao 5與蘋果褪綠葉斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV)的核苷酸、 氨基酸序列比對， 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析， 鑒定了桃褪綠葉斑病毒(peach chlorotic leaf spot virus， PCLSV)為Trichovirus的新種． 目前ICTV可以僅根據(jù)序列信息對病毒進(jìn)行分類， 在缺乏表型數(shù)據(jù)的情況下， 可以從病毒編碼序列數(shù)據(jù)中推斷出基因組結(jié)構(gòu)、 同源基因的存在以及可能的寄主范圍等病毒特征， 用來鑒定病毒．

2.2 病毒檢測流程

應(yīng)用HTS技術(shù)檢測植物病毒的流程包括： 樣品制備、 文庫構(gòu)建、 平臺測序、 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果驗(yàn)證[27]． 首先， 測序樣品有總RNA、 總DNA、 雙鏈RNA(double-stranded RNA， dsRNA)、 病毒粒子相關(guān)核酸(virion-associated nucleic acids， VANA)、 小RNA(small RNA， sRNA)等[28]． 提取總RNA和VANA可檢測到ssRNA、 dsRNA、 ssDNA、 dsDNA等核酸類型的病毒； 提取總DNA可檢測到ssDNA和dsDNA核酸類型的病毒； dsRNA測序能獲得病毒的特異序列[29]； sRNA測序可同時(shí)檢測DNA、 RNA病毒和內(nèi)源性病毒元件(endogenous viral elements， EVEs)， 病毒來源的sRNA在序列上是重疊的， 可組裝sRNA獲得病毒基因組． 常提取總RNA作為測序模板， 使用聚腺苷化RNA轉(zhuǎn)錄本去除核糖體RNA， 可獲得更高的覆蓋率[30]． 其次， 文庫構(gòu)建包括核酸片段化， RNA反轉(zhuǎn)錄， 添加接頭、 引物和樣品序列標(biāo)簽， PCR富集和文庫質(zhì)檢[31]． 再次， 應(yīng)選擇合適的測序平臺． Illumina測序平臺優(yōu)勢有高通量、 低成本； Ion Torrent平臺適用于微量DNA測序， 可能有同聚物區(qū)域測序錯(cuò)誤； PacBio平臺優(yōu)勢是長讀長、 覆蓋均勻， 但成本高； Nanopore平臺優(yōu)勢是超長讀長， 缺點(diǎn)是錯(cuò)誤率高[32](表1)． Illumina測序平臺在高通量測序檢測植物病毒方面得到廣泛應(yīng)用． Illumina測序儀采用邊合成邊測序的方法， 主要流程有： ① 文庫構(gòu)建； ② 橋式擴(kuò)增成簇反應(yīng)； ③ 邊合成邊測序過程： 將不同熒光標(biāo)記的dNTP、 聚合酶、 引物等加入到測序通道中， 伴隨堿基加入會(huì)激發(fā)熒光， 由光學(xué)采集系統(tǒng)記錄熒光， 直到合成全部雙鏈DNA[33-35]． 生物信息學(xué)分析則基于Illumina測序平臺[36]獲得原始數(shù)據(jù)， 用Geneious[33]軟件去除寄主基因組序列， 如線粒體、 葉綠體和核糖體RNA序列等， 篩除不能比對到病毒參考基因組(非目標(biāo)大類基因組)序列， 獲得干凈讀長[37]； 采用裝配工具從頭組裝， 用NCBI-BLASTn搜索同源病毒核酸序列， 參考NCBI序列來組裝病毒基因組； BLASTx搜索同源蛋白序列， 采用Find ORF工具鑒定開放閱讀框， 在BLASTp中鑒定同源序列和保守區(qū)域， 序列比對采用ClustalW[38]， 基于MEGA v.7.0.26[39]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 揭示病毒親緣關(guān)系． 最后， 結(jié)合測序結(jié)果和參考病毒序列設(shè)計(jì)病毒的特異引物， 開展RT-PCR擴(kuò)增， 檢測病毒種類． 如能擴(kuò)增到特異條帶， 說明樣品染毒， 對陽性條帶克隆測序， 通過NCBI-BLASTn搜索鑒定病毒． 劉雪建[40]使用此方法鑒定了采自浙江省和江西省蔬菜樣品中的辣椒斑駁病毒(pepper mottle virus， PepMoV)、 辣椒隱癥病毒(pepper cryptic virus， PCV)、 大豆褪綠斑駁病毒(soybean chlorotic mottle virus， SoyCMV)等6種病毒．

表1 第二代和第三代測序技術(shù)對比[32]

3 高通量測序技術(shù)在植物病毒檢測中的應(yīng)用

迄今已知的植物病毒種類超過1 000種[2]， 一種病毒可侵染多種植物， 而同種植物又可被多種病毒侵染． 采用HTS技術(shù)， 在蔬菜、 糧食、 水果等作物中均檢測到多種病毒[41]， 研究案例總結(jié)如下．

3.1 蔬菜作物中植物病毒的檢測

我國廣泛種植豆科、 十字花科、 茄科和葫蘆科等常見蔬菜， 病毒病已經(jīng)成為危害我國蔬菜生產(chǎn)的第一類病害[42]． 嚴(yán)重危害蔬菜作物病毒主要有： 煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus， TMV)、 番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus， TSWV)、 CMV、 馬鈴薯Y病毒(potato virus Y， PVY)、 馬鈴薯X病毒(potato virus X， PVX)、 花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus， CaMV)等[42]． TMV可侵染茄科、 十字花科等30多科300多種植物[43]； TSWV的染病特征是成熟果實(shí)上有亮黃色環(huán)紋或古銅色斑點(diǎn)[44]； 馬鈴薯Y病毒侵染后可引起馬鈴薯植株葉脈壞死、 葉面黃化褪綠、 塊莖環(huán)斑壞死等癥狀， 復(fù)合侵染危害較大[45]．

Wei等[46]采集了11個(gè)大豆(Glycine max)樣本， 提取總RNA進(jìn)行Illumina測序， 鑒定3個(gè)樣品存在豇豆輕度斑駁病毒(cowpea mild mottle virus， CPMMV)單獨(dú)侵染， 8個(gè)樣品存在CPMMV和大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus， SMV)復(fù)合侵染． Tang等[47]首次報(bào)道了感染小白菜(BrassicacampestrisL. ssp. chinensis)的一種新病毒， 并將其命名為brassica campestris chinensis cryptic virus 1(BCCV1)， 通過對RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase， RdRp)和CP進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析， 確定BCCV1為Partitiviridae下Deltapartitivirus新成員． Beris等[48]采用Illumina測序技術(shù)， 首次報(bào)道侵染茄子(Solanummelongena)的茄斑駁皺紋病毒(eggplant mottled crinkle virus， EMCV)． Pecman等[49]采用Illumina測序技術(shù)測序樣品小RNA， 發(fā)現(xiàn)一種番茄新病毒——天仙子花葉病毒(henbane mosaic virus， HMV)． HTS技術(shù)可以快速鑒定樣品中存在的病毒， 結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以驗(yàn)證病毒的致病性和樣品是否存在多種病毒復(fù)合侵染； 結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)確定病毒的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系， 為新病毒鑒定提供證據(jù)， 對明確研究病毒的生物學(xué)特征和確定其分類地位具有十分重要的作用．

3.2 糧食作物中植物病毒的檢測

由于昆蟲群體等傳毒介體的作用， 以及作物品種抗病性較低， 使得我國糧食作物如水稻、 玉米等的多種病毒病危害嚴(yán)重， 發(fā)生面積擴(kuò)大及危害程度迅速上升． 通過HTS技術(shù)對病毒來源sRNA測序， 是檢測作物病毒的重要方法．

當(dāng)病毒入侵寄主細(xì)胞后， RNA病毒的基因組復(fù)制中間物或DNA病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物間會(huì)形成雙鏈dsRNA中間體， 這些病毒的dsRNA會(huì)被細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶Dicer識別并產(chǎn)生大量病毒來源長度為21～24 nt的小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)[50]． Kreuze等[51]提出通過深度測序獲得sRNA序列， 用來鑒定新病毒． Xu等[52]通過sRNA測序和生物信息學(xué)方法， 分析SRBSDV的siRNA序列， 證實(shí)了SRBSDV可以調(diào)控水稻RNA沉默通路相關(guān)基因的表達(dá)， 使寄主染?。?我國玉米的主要侵染病毒有： 水稻黑條矮縮病毒(rice black-streaked dwarf virus， RBSDV)、 甘蔗花葉病毒(sugarcane mosaic virus， SCMV)、 玉米褪綠斑駁病毒(maize chlorotic mottle virus， MCMV)等12種病毒[53]． 陳莎[54]采用sRNA深度測序技術(shù)， 鑒定了云南省和貴州省玉米病毒病的病原種類， 通過重疊群拼接和比對共篩選了7種病毒， 其中3種新病毒是玉米黃化花葉病毒(maize yellowing mosaic virus， MYMV)、 玉米相關(guān)的形影病毒(maize-associated umbravirus， MAUV)以及玉米相關(guān)的整體病毒1(maize-associated totivirus 1， MATV1)． 利用sRNA測序可同時(shí)檢測RNA病毒、 DNA病毒和類病毒， 是一種高通量檢測病毒的方法． 在植物未出現(xiàn)明顯癥狀的感染早期， 小RNA的高通量測序可對病毒進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測， 為后續(xù)的病毒病防治爭取時(shí)間．

3.3 果樹中植物病毒的檢測

高通量測序技術(shù)已在柑橘[55]、 蘋果和梨[56]等果樹上應(yīng)用． 果樹被病毒侵染之后樹體周身帶毒且終生受害， 建立高靈敏度的病毒檢測技術(shù)對果樹病毒病預(yù)警和預(yù)防有重要意義．

Matsumura等[57]使用Illumina平臺對柑橘突然死亡和無癥狀植物的轉(zhuǎn)錄組和小RNA測序分析， 發(fā)現(xiàn)柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus， CTV)是引起柑橘突然死亡的主要病毒， 其次還有柑橘突然死亡相關(guān)病毒(citrus sudden death-associated virus， CSDaV)以及柑橘內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(citrus endogenous pararetrovirus， CitPRV)， 還發(fā)現(xiàn)citrus jingmen-like virus(CJLV)和citrus virga-like virus(CVLV)兩種新病毒． 根據(jù)侵染特點(diǎn)， 引起蘋果病毒病的病毒可分為非潛隱性病毒和潛隱性病毒兩大類， 非潛隱性病毒在蘋果上的癥狀易于識別， 特征明顯， 潛隱性病毒對蘋果生長結(jié)實(shí)無明顯影響， 但易引起果實(shí)個(gè)小晚熟， 產(chǎn)量品質(zhì)下降． Lim等[58]通過Illumina測序技術(shù)檢測到了非潛隱病毒蘋果綠皺相關(guān)病毒(apple green crinkle associated virus， AGCaV)， 以及蘋果莖痘病毒(apple stem pitting virus， ASPV)、 蘋果莖溝病毒(apple stem grooving virus， ASGV)兩種潛隱病毒， 并首次發(fā)現(xiàn)apple hammerhead viroid(AHVd)病毒感染蘋果樹． 楊潔萍等[59]利用Illumina測序技術(shù)檢測出梨樹已知病毒ASPV、 ASGV和ACLSV， 以及梨樹中新發(fā)現(xiàn)的BrYV； Read等[60]通過Illumina測序和生物信息學(xué)分析， 發(fā)現(xiàn)了葡萄柚病毒分離物， 為單基因水平的重組事件和種群精細(xì)定位提供證據(jù)． 因此， 高通量測序技術(shù)也為病毒遺傳變異研究提供證據(jù)[61]．

高通量測序技術(shù)鑒定植物病毒的核心工作是測序數(shù)據(jù)分析， 公共數(shù)據(jù)庫中大量的病毒基因組序列是病毒檢測的關(guān)鍵， 構(gòu)建完善的病毒基因組序列資源庫， 對于精準(zhǔn)防控植物病毒或類病毒是十分迫切的需求．

4 高通量測序技術(shù)優(yōu)勢與缺陷

高通量測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有： ① 靈敏性高， 快速， 高通量． 可以在一天內(nèi)得到全部病毒樣品的序列信息， 能夠快速診斷某些暴發(fā)性病害及疑難雜癥的病原， 為病害防治提供依據(jù)； ② 通過公共數(shù)據(jù)庫資源比對來鑒定新病毒， 通過重疊siRNA方法也能鑒定新病毒， 如葡萄藤新類病毒的發(fā)現(xiàn)[62]； ③ 檢測不同類型核酸， 提高病毒檢測的廣泛性[63]， 例如提取總RNA可檢測到ssRNA，dsRNA，ssDNA，dsDNA等核酸病毒， 在實(shí)際應(yīng)用中根據(jù)需求構(gòu)建不同的測序文庫； ④ 可同時(shí)檢測來自于不同地區(qū)不同寄主中的病毒， 為研究病毒變異和進(jìn)化研究提供線索； ⑤ 可鑒定無明顯癥狀的潛隱性病毒， 例如Darko等[64]首次報(bào)道馬其頓共和國北部地區(qū)柿子潛隱病毒(persimmon cryptic virus， PeCV)， 豐富了病毒公共數(shù)據(jù)庫資源．

目前， 利用HTS技術(shù)檢測病毒的主要困難有： ① 難以獲取高質(zhì)量病毒核酸庫， 需要構(gòu)建小RNA文庫來富集病毒序列， 提高測序靈敏度； ② 某些病毒基因組含量極低， 不易獲得， 使用Trizol法提取植物總RNA制備測序文庫、 制備小RNA文庫和去除核糖體RNA建庫來降低寄主基因組含量； ③ 難以獲得低豐度病毒的完整基因組序列， 一方面讀長拼接時(shí)會(huì)產(chǎn)生缺口， 需要借助常規(guī)PCR補(bǔ)平， 另一方面病毒5’或3’端序列缺失， 需要根據(jù)已知病毒序列設(shè)計(jì)特異性引物， 用RACE擴(kuò)增和Sanger測序補(bǔ)平； ④ 目前被列入檢疫名錄實(shí)施管理的致病病原種類有限， 需要將病株接種到健康植物上驗(yàn)證是否致病， 加強(qiáng)對新病毒和類病毒的管理； ⑤ 研究者的知識積累與辨別能力， 影響病毒鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性， HTS技術(shù)檢測植物病毒產(chǎn)生大量的遺傳信息數(shù)據(jù)， 而測序結(jié)果的組裝、 比對等是鑒定病毒的關(guān)鍵， 科研工作者應(yīng)該積累遺傳學(xué)、 生物信息學(xué)等基礎(chǔ)知識和掌握先進(jìn)技能， 以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性．

病毒病導(dǎo)致作物品質(zhì)下降， 減產(chǎn)甚至絕收， 制約了蔬菜、 糧食、 水果等產(chǎn)業(yè)發(fā)展． 然而目前對病毒病種類、 分布、 危害等缺乏系統(tǒng)研究， 對某些病毒及新病毒防治甚至缺乏研究， 另外病毒變異速度快， 增加了病毒病防治的研究難度． 高通量測序技術(shù)可一次性鑒定出樣品攜帶的多個(gè)病毒， 快速實(shí)現(xiàn)植物樣品中所有轉(zhuǎn)錄組的具體分析， 為植物病毒普查和防治提供一定的理論依據(jù)．