人參實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定方法的建立

周林， 孫濤， 滕少娜， 陳亭旭，何玲， 劉靜遠(yuǎn)， 付海濱， 孔德英

1. 重慶海關(guān)技術(shù)中心， 重慶 400020； 2. 國(guó)家中藥材物種鑒定及質(zhì)量安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400020；3. 上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 上海 200135； 4. 沈陽(yáng)海關(guān)技術(shù)中心， 沈陽(yáng) 110016

人參Panaxginseng被稱為“百草之王”， 是我國(guó)應(yīng)用最廣泛的名貴中藥材， 其地理分布有局限性， 對(duì)生態(tài)環(huán)境要求甚嚴(yán)， 其野生資源由于長(zhǎng)期無(wú)控制地采挖幾近枯竭， 被列入《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》． 同時(shí)， 人參作為饋贈(zèng)佳品經(jīng)常被游客攜帶或郵寄跨境， 是海關(guān)植物檢疫工作中非貿(mào)渠道執(zhí)法時(shí)高頻截獲物之一． 由于人參中的俄羅斯聯(lián)邦種群屬于瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(CITES)附錄II中所列物種， 因此探索人參種類鑒定方法， 積極履行CITES公約， 有助于保護(hù)其瀕危野生資源． 同時(shí)， 市面上使用華山參根、 商陸根、 紫茉莉根、 櫨蘭根等冒充人參的現(xiàn)象屢見不鮮， 為人參的鑒定工作增加了很大的難度， 因此亟待建立準(zhǔn)確快速的人參鑒定技術(shù)．

人參類中藥的傳統(tǒng)鑒定方法主要有基原鑒定、 性狀鑒定、 顯微鑒定、 理化鑒定和病原鑒定[1-3]． 傳統(tǒng)鑒定方法的理論基礎(chǔ)建立于分類群的性狀特征分析， 這些性狀特征是與環(huán)境緊密相關(guān)的表型， 受環(huán)境影響較大． 從分子遺傳學(xué)角度來(lái)看， 物種表型的差異歸根結(jié)底應(yīng)追溯到其基因型的差異， 即DNA序列差異[4]． 因此， 對(duì)基因組序列差異的比較研究無(wú)疑為植物分類和鑒定提供了重要依據(jù)．

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展， 基于DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒定中藥材的研究應(yīng)運(yùn)而生， 并取得了快速發(fā)展． 從1994年隨機(jī)引物PCR(arbitrarily primed PCR， AP-PCR)首次用于人參、 西洋參的鑒別以來(lái)[5]， DNA分子標(biāo)記鑒定技術(shù)應(yīng)用于參類藥材鑒別已有不少報(bào)道， restriction fragment length polymorphism(RFLP)、 random amplified polymorphic DNA(RAPD)、 amplified fragment length polymorphism(AFLP)、 sequence characterized amplified region(SCAR)、 single nucleotide polymorphism(SNP)[6-10]等技術(shù)相繼應(yīng)用于參類藥材的鑒別鑒定． 然而， 這些技術(shù)存在操作步驟繁瑣、 工作量大、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差等缺點(diǎn)．

實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為基因檢測(cè)的重要手段， 具有操作方便、 靈敏、 快捷、 結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)[11-13]． 本文開發(fā)了一種適用于人參的實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定方法， 以期為我國(guó)CITES履約、 海關(guān)執(zhí)法、 市場(chǎng)監(jiān)管等提供更加科學(xué)準(zhǔn)確的技術(shù)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品包括30個(gè)人參樣品以及其他人參屬或形態(tài)近似的16個(gè)物種的28個(gè)樣品， 共計(jì)17種58個(gè)樣品(表1)． 樣品經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室鑒定后， 結(jié)合Internal Transcribed Spacer(ITS)序列測(cè)序鑒定確定種名． 樣品保存于國(guó)家中藥材物種鑒定及質(zhì)量安全檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室．

表1 試驗(yàn)材料及來(lái)源

1.2 試劑與儀器

磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自珠海寶瑞生物公司； Premix Taq ? Version 2.0、 Premix Ex Taq(Probe qPCR)購(gòu)自寶生物(大連)有限公司． 球磨儀(德國(guó)萊馳的MM400)， 全自動(dòng)核酸提取儀(賽默飛世爾Kingfisher Duoprime)， 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀(美國(guó)ABI stepone plus)．

1.3 DNA提取

用70%酒精對(duì)樣品進(jìn)行擦洗， 再在無(wú)水乙醇中浸泡5 min， 晾干后用球磨儀將樣品研磨成粉[14]． 按照磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行樣品DNA提取， 提取的DNA用Nanodrop One超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定核酸質(zhì)量和濃度， 隨后保存于-20 ℃冰箱備用．

1.4 引物與探針設(shè)計(jì)

分別比對(duì)分析人參屬物種及人參常見偽混品的常用備選條碼基因及18SrRNA基因序列， 篩選人參種內(nèi)保守、 種間特異區(qū)域． 在18SrRNA基因序列中， 發(fā)現(xiàn)人參在497 bp和501 bp處為G和C， 其他物種為C和G， 且種內(nèi)高度保守(圖1)． 據(jù)此用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)特異引物探針， 引物為Pgf(5′-CACGGGGAGGTAGTGACAATA-3′)/ Pgr(5′-AGACTTGCCCTCCAATGGAT 3′)， 探針為Pgp(FAM- CGGGCTGATTCAGTCT-MGB)， 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成．

1.5 實(shí)時(shí)熒光PCR

PCR反應(yīng)體系為20 μL， 包括10 μL 2×熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液， 上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L)， 探針0.8 μL(10 μmol/L)， DNA 模板4 μL， 滅菌去離子水補(bǔ)至20 μL．

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性30 s； 然后以95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)． 每個(gè)循環(huán)中60 ℃ 30 s結(jié)束時(shí)設(shè)置熒光通道采集熒光．

1.6 靈敏度測(cè)試

將陽(yáng)性樣品RS-06的DNA 測(cè)定核酸濃度后進(jìn)行10倍梯度稀釋， 共稀釋成8個(gè)濃度梯度， 然后按照1.5中的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增， 測(cè)試引物探針的檢測(cè)靈敏度．

紅框處示意人參18S rRNA序列在497 bp和501 bp處為G和C， 其他物種為C和G．圖1 人參與其他5個(gè)物種的18S rRNA序列比對(duì)圖

2 結(jié)果與分析

2.1 探針特異性

利用設(shè)計(jì)的引物探針對(duì)58份DNA樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)， 結(jié)果表明30份人參樣品DNA均有特異擴(kuò)增曲線， 而供試的其他28份樣品DNA及空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增曲線(圖2)． 其中， 4個(gè)人參片/粉劑的CT值相對(duì)偏高， 可能是因?yàn)榕谥乒に噷?dǎo)致(箭頭所示)． 結(jié)合在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)中的同源性與特異性比較結(jié)果， 說(shuō)明該引物與探針用于人參檢測(cè)具有良好的特異性．

A區(qū)： 人參樣品； B區(qū)： 非人參樣品及空白對(duì)照； 箭頭所示為4個(gè)人參片/粉劑(RS27-RS30)．圖2 人參實(shí)時(shí)熒光PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

2.2 靈敏度檢測(cè)

用滅菌去離子水將提取的人參(樣品編號(hào)RS-06)DNA(初始濃度為3.04×104pg/μL)10倍梯度稀釋成8個(gè)系列梯度， 稀釋后濃度分別為3.04×104pg/μL～3.04×10-3pg/μL， 取4 μL作為模板用于靈敏度檢測(cè)， 結(jié)果表明DNA原液及101～106倍稀釋液樣品均得到典型的擴(kuò)增曲線(圖3)．

DNA濃度從3.04×104pg/μL～3.04×10-2pg/μL對(duì)應(yīng)的CT值分別為17.11，19.95，23.08，26.67，30.3，33.63，36.74． 以擴(kuò)增曲線的CT值為縱坐標(biāo)， 相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)． 所得線性方程為y=-3.375x+ 40.275， 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.997， 擴(kuò)增效率為97.83%， 最低檢測(cè)限是0.03 pg/μL反應(yīng)．

①～⑧分別為初始濃度3.04×104 pg/μL的8級(jí)10倍稀釋DNA樣品的擴(kuò)增曲線．圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)人參靈敏度

圖4 人參實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的中藥材鑒定手段由于易受環(huán)境條件的影響或植物本身的限制， 人為干擾因素較多， 無(wú)法直接體現(xiàn)種質(zhì)的遺傳特征， 難以快速得到準(zhǔn)確的結(jié)果． DNA分子鑒定技術(shù)因其準(zhǔn)確性和客觀性， 在中藥材鑒定中的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的重視． DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、 相對(duì)較短的DNA序列來(lái)進(jìn)行物種鑒定的一種DNA分子鑒定技術(shù)， 具有適應(yīng)性廣、 樣品用量少、 結(jié)果準(zhǔn)確性高及可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[15-17]． 然而， 一些中藥材在生產(chǎn)過(guò)程中的加工工藝會(huì)引起DNA的嚴(yán)重降解， 提取到的DNA往往濃度較低、 質(zhì)量較差， 且易含較多的PCR抑制劑[18-19]， 這時(shí)使用DNA條形碼鑒定法較難取得理想的效果． 本研究中的樣品RS-29和RS-30人參粉產(chǎn)品， 利用普通PCR進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)條帶較弱， 送樣后因濃度較低無(wú)法測(cè)序， 但利用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)卻有典型的擴(kuò)增曲線，CT值分別為32.95和33.42， 說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光定量PCR較普通PCR能更好地克服中藥材DNA部分降解造成的缺陷．

本研究通過(guò)BLAST序列比對(duì)， 選取人參18SrRNA序列， 設(shè)計(jì)開發(fā)了人參特異性引物探針． 該引物探針可將其他人參屬中藥材和市場(chǎng)上常見偽品與人參進(jìn)行區(qū)分， 表現(xiàn)出良好的特異性． 李忠華等[20]根據(jù)人參的5.8SrRNA及ITS2序列與常見近源物種的差異設(shè)計(jì)引物探針， 研究了人參的實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定， 其靈敏度達(dá)到1 pg/μL反應(yīng)． 本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法靈敏度達(dá)到0.03 pg/μL反應(yīng)， 靈敏度有所提高．

本方法的建立有助于人參及其加工品被快速、 準(zhǔn)確、 靈敏地鑒定， 也可有效地區(qū)分形態(tài)近似的偽混品， 可在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)行推廣， 以期為人參藥材鑒定、 市場(chǎng)監(jiān)管等提供更加科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)． 同時(shí)， 本方法的建立有助于進(jìn)一步規(guī)范出入境人參的監(jiān)管， 為口岸快速、 準(zhǔn)確地鑒定提供依據(jù)， 對(duì)防止人參種質(zhì)資源流失， 維護(hù)我國(guó)物種資源安全有著重要的意義．