夏枯草口服液HPLC指紋圖譜的建立及5種成分的含量測定*

湯蕊，高慶軍，楊慧芳1,，羅雪1,，陳星宏1,，趙代偉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 甲狀腺外科，貴州 貴陽 550004；3.貴州省第二人民醫(yī)院 普外科，貴州 貴陽 550004)

夏枯草口服液是由夏枯草單味藥材經(jīng)提取濃縮制成的單方制劑，收載于《中國藥典》(2020年版)一部[1]，主要含有迷迭香酸、咖啡酸等有機酸類成分[2]，具有清火名目、散結(jié)消腫等功效，用于甲狀腺腫大、乳腺增生等疾病[3]，其療效確切、不良反應(yīng)少[4-5]。目前，對夏枯草口服液相關(guān)研究主要集中于臨床方面[6-7]，質(zhì)量控制研究較少[8-9]；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對迷迭香酸與總黃酮含量進(jìn)行定量測定[1]，而中藥成分復(fù)雜，簡單的定量難以對其整體質(zhì)量進(jìn)行有效控制。指紋圖譜作為一種半定量技術(shù)，為中藥整體質(zhì)量控制提供了切實有效的方法，已成為國際普遍接受的中藥質(zhì)量評價模式[10-14]。為確保夏枯草口服液質(zhì)量的均一、穩(wěn)定、安全，進(jìn)一步加強該制劑整體質(zhì)量的控制，更好地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價值，本研究采用HPLC建立夏枯草口服液指紋圖譜，同時測定其中的迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛5種成分，以期為夏枯草口服液質(zhì)量控制與評價奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1儀器 Thermo Fisher UltiMate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司，配備系統(tǒng)控制器、脫氣組件、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、溫控樣品室、四元梯度泵、Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站)，Mettler AE-240型電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)儀器有限公司]，KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q Integral Water Purification System 超純水機(美國Millipore公司)。

1.1.2試藥 25批次夏枯草口服液(規(guī)格：每支裝10 mL，批號170404、170405、170406、170411、170412、170413、170415、170417、181103、190103、190104、190105、190109、190111、190113、190117、190202、190203、190204、190206、190207、190210、190212、190213、190218)，分別表示為S1～S25，均由貴州新天藥業(yè)股份有限公司提供；迷迭香酸對照品(批號190812)、咖啡酸對照品(批號191028)、丹參素對照品(批號190721)、原兒茶酸對照品(批號191218)、原兒茶醛對照品(批號200510)，純度均≥98%，均購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，乙腈為HPLC級，甲醇、磷酸等試劑均為AR級，水為自制超純水。

1.2 研究方法

1.2.1色譜條件 色譜柱為ACE EXCEL 5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～35 min、5%～20%A，35～37 min、20%～26%A，37～56 min、26%～32%A，56～64 min、32%～38%A，64～92 min、38%～59%A，92～105 min、59%～70%A，105～110 min、70%～95%A)；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm。

1.2.2對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，加20%甲醇制成每1 mL含迷迭香酸1.180 mg、咖啡酸0.129 4 mg、丹參素1.186 mg、原兒茶酸0.150 9 mg、原兒茶醛0.206 8 mg的混合對照品溶液。

1.2.3供試品溶液的制備 取夏枯草口服液，精密量取2.0 mL，置5 mL量瓶中，加20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4指紋圖譜的建立 (1)精密度試驗：取夏枯草口服液(S9)同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣測定6次得各色譜峰保留時間和峰面積，選取參照峰(S)計算各共有峰相對保留時間(RRT)及相對峰面積(RPA);(2)重復(fù)性試驗：取夏枯草口服液(S9)平行制備6份供試品溶液進(jìn)樣測定得各色譜峰保留時間和峰面積，選取參照峰(S)計算各共有峰RRT及RPA;(3)穩(wěn)定性試驗：取夏枯草口服液(S9)同一供試品溶液室溫下于0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣測定得各色譜峰保留時間和峰面積，選取參照峰(S)計算各共有峰RRT及RPA;(4)對照指紋圖譜的建立：取各批次夏枯草口服液進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)”建立25批次夏枯草口服液指紋圖譜，并計算相似度。

1.2.5含量測定 (1)色譜條件、混合對照品溶液及供試品溶液的制備：同1.2.1、1.2.2、1.2.3項下方法;(2)線性關(guān)系考察：精密吸取迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛的混合對照品溶液適量，倍比稀釋配制成系列混合對照品溶液進(jìn)樣測定；以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算回歸方程;(3)精密度試驗：取夏枯草口服液(S9)同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣測定6次得各色譜峰峰面積，計算迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛的RSD;(4)重復(fù)性試驗：取夏枯草口服液(S9)平行制備6份供試品溶液進(jìn)樣測定得各色譜峰峰面積，計算迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛的含量及RSD;(5)穩(wěn)定性試驗：取夏枯草口服液(S9)同一供試品溶液室溫下于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測定得各色譜峰峰面積，計算迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛的RSD;(6)加樣回收率試驗：取已知5種成分含量的夏枯草口服液(S9)6份，每份精密量取1.0 mL，分別精密加入對照品溶液適量、制備供試品溶液，進(jìn)樣測定得色譜峰峰面積，計算迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛的平均回收率及RSD;(7)樣品測定：取夏枯草口服液樣品，共25批次，每批2份，制備供試品溶液進(jìn)樣測定得各色譜峰峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計算25批次樣品中迷迭香酸、咖啡酸、丹參素、原兒茶酸和原兒茶醛的含量。

2 結(jié)果

2.1 指紋圖譜結(jié)果

2.1.1方法學(xué)考察 精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示迷迭香酸等50個共有峰RRT的RSD分別≤0.446%、≤0.559%、≤0.614%，RPA的RSD分別≤2.94%、≤0.559%、≤2.81%，表明儀器精密度良好、方法重復(fù)性良好、供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.2對照指紋圖譜的建立與共有峰的指認(rèn) HPLC對照指紋圖譜和25批次夏枯草口服液疊加指紋圖譜見圖1，共標(biāo)定50個共有峰。經(jīng)對照品比對，并結(jié)合紫外光譜信息分析，指認(rèn)出其中13號峰(丹參素)、14號峰(原兒茶酸)、16號峰(原兒茶醛)、22號峰(咖啡酸)、39號峰(迷迭香酸)，混合對照品溶液和夏枯草口服液樣品(S9)HPLC圖見圖2。以保留時間適中、分離度較好、峰面積較大、峰形較穩(wěn)定的39號峰(迷迭香酸)為參照峰(S)，計算指紋圖譜中各共有峰的RRT和RPA，結(jié)果迷迭香酸等50個共有峰RRT的RSD≤0.833%，表明不同批次樣品所含化學(xué)成分種類基本一致，但其RPA的RSD相差較大、表明各化學(xué)成分含量差異較大。

注：1～50為指紋圖譜共有峰編號。圖1 夏枯草口服液HPLC對照指紋圖譜(A)和25批次樣品疊加指紋圖譜(B)Fig.1 HPLC controlled fingerprint (A) and superimposed fingerprint (B) of 25 batches of xiakucao oral liquid

注：13為丹參素、14為原兒茶酸、16為原兒茶醛、22為咖啡酸、39為迷迭香酸。圖2 混合對照品(A)和夏枯草口服液S9(B)的HPLC圖Fig.2 HPLC of mixed control (A) and xiakucao oral liquid S9 (B)

2.1.3指紋圖譜相似度評價 相似度評價結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，不同批次夏枯草口服液相似度均>0.90，表明夏枯草口服液的制備工藝與整體質(zhì)量較穩(wěn)定。

表1 25批次夏枯草口服液指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab.1 Results of similarity evaluation for 25 batches of xiakucao oral liquid fingerprint

2.2 指紋圖譜化學(xué)模式識別

2.2.1主成分分析(PCA) 以迷迭香酸等50個共有峰的峰面積為變量，運用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析，特征值及方差貢獻(xiàn)率見表2。前3個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為97.154%，表明該3個成分能代表夏枯草口服液的基本特征和主要信息。主成分載荷圖可說明原始變量與主成分的相關(guān)程度，結(jié)果顯示，39號峰(迷迭香酸)、13號峰(丹參素)、45號峰、16號峰(原兒茶醛)、22號峰(咖啡酸)、50號峰、29號峰對樣品的整體質(zhì)量起主要影響作用。見圖3。PCA散點得分圖表明25批次樣品主要可分為2類。見圖4。

表2 3個主成分的特征值與方差貢獻(xiàn)率Tab.2 Eigenvalues and contribution rates of 3 principal components

圖3 夏枯草口服液PCA(3D)載荷圖Fig.3 Loading plot (3D) in xiakucao oral liquid

圖4 25批次夏枯草口服液PCA散點圖Fig.4 PCA scatter diagram in 25 batches of xiakucao oral liquid

2.2.2正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA) 為進(jìn)一步分析不同分類樣品間差異，采用有監(jiān)督的OPLS-DA建模研究，OPLS-DA模型主成分回歸系數(shù)Q2=0.959、模型區(qū)分參數(shù)R2Y=0.778、矩陣結(jié)實率R2X=0.658，表明模型預(yù)測能力較好。對變量重要性投影值(VIP)參數(shù)進(jìn)行分析，見圖5，VIP>1的色譜峰為39號峰(迷迭香酸)、50號峰、13號峰(丹參素)，表明迷迭香酸、丹參素等3種成分對樣本分類貢獻(xiàn)較大，是影響樣品產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志物。

圖5 夏枯草口服液中各成分的VIP值Fig.5 VIP values of different ingredients in xiakucao oral liquid

2.3 含量測定結(jié)果

2.3.1方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察結(jié)果見表3，5種指標(biāo)成分在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;(2)精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗測得5種指標(biāo)成分峰面積的RSD見表4，其中重復(fù)性試驗測得夏枯草口服液每1 mL含迷迭香酸1.729 mg、咖啡酸0.071 5 mg、丹參素1.370 mg、原兒茶酸0.056 3 mg、原兒茶醛0.083 4 mg，表明儀器精密度良好、方法重復(fù)性良好、供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好;(3)加樣回收率結(jié)果見表5，丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸的平均加樣回收率在98.44%～103.6%，RSD≤2.67%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表3 夏枯草口服液5種成分相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系Tab.3 Linear relationship of various constituents in xiakucao oral liquid

表4 精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗Tab.4 The precision,repeatability,and stability tests of various constituents

表5 夏枯草口服液5種成分相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的回收率試驗Tab.5 The recovery tests of various constituents

2.3.2樣品測定 測得樣品中迷迭香酸含量均不少于0.80 g/L，表明所測多批次夏枯草口服液均符合該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]，但不同批次制劑間同一成分含量存在一定差異。見表6。

表6 25批夏枯草口服液中5種成分的含量(n=2)Tab.6 Contents of five constituents in 25 batches of xiakucao oral liquid(n=2)

3 討論

夏枯草口服液由夏枯草水煎制成[1]，大極性成分較多，對樣品采用直接濾過、萃取、揮干復(fù)溶等方法處理，進(jìn)樣分析發(fā)現(xiàn)樣品中所含色譜峰數(shù)目均無明顯變化，而其中迷迭香酸含量較高，最終確定采用20%甲醇稀釋后直接濾過制備供試品溶液，結(jié)果表明按稀釋的方法制備供試品溶液，無需經(jīng)過復(fù)雜前處理，簡單快捷，可較多的保留樣品中的化學(xué)成分，且基線平穩(wěn)，重復(fù)性、加樣回收率試驗良好。

本試驗對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了ACE EXCEL 5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、ACE EXCEL 5 Super C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、ACE EXCEL 5 C18AR(250 mm×4.6 mm,5 μm)等色譜柱對夏枯草口服液中成分的分離情況，結(jié)果采用ACE EXCEL 5 C18色譜柱的分離效果與峰形優(yōu)于其余兩種；夏枯草口服液含有多種有機酸成分[2]，為抑制拖尾得到較好峰形，考察了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸4種流動相體系，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相，峰形較好，基線較平穩(wěn)；試驗采用二極管陣列檢測器DAD對樣品進(jìn)行紫外全波長掃描，分析發(fā)現(xiàn)在280 nm波長條件下，色譜峰數(shù)目較多，信息量較大，基線平穩(wěn)，含量測定指標(biāo)成分的分離度良好，故選擇280 nm作為檢測波長；試驗比較了25 ℃、30 ℃、35 ℃等柱溫及0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min等流速對色譜峰分離的影響，最終確定柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL/min，結(jié)果色譜峰分離良好、保留時間適中、重復(fù)性良好。在擬定的色譜條件下，各成分的峰形較好、分離度良好，基線平穩(wěn)，重復(fù)性良好。

相似度評價結(jié)果表明夏枯草口服液制備工藝與整體質(zhì)量較穩(wěn)定，通過PCA及OPLS-DA尋找到影響樣品產(chǎn)生差異的成分主要為39號峰(迷迭香酸)、13號峰(丹參素)、16號峰(原兒茶醛)、22號峰(咖啡酸)、50號峰等色譜峰，其中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸等是夏枯草口服液的主要活性成分，在抗腫瘤、免疫抑制等方面均表現(xiàn)出顯著作用，對甲狀腺、乳腺等癌癥具有良好的治療效果[15-20]。故而本試驗選擇迷迭香酸、咖啡酸、丹參素作為含量測定指標(biāo)成分，并同時測定原兒茶酸和原兒茶醛的含量，進(jìn)一步兼顧了微量成分與多成分融合起調(diào)節(jié)作用的傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，豐富了夏枯草口服液的質(zhì)控指標(biāo)。含量測定結(jié)果顯示，測定樣品所含迷迭香酸的含量均符合該制劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但各成分含量RSD均較大，提示在該制劑的生產(chǎn)中需注意原料藥材的采購、質(zhì)控、投料或勾兌及制備工藝的穩(wěn)定性，以確保制劑質(zhì)量的均一、穩(wěn)定、安全、有效，更好地發(fā)揮其臨床應(yīng)用價值。

本研究首次建立了夏枯草口服液的HPLC指紋圖譜，并同時測定其中5種成分含量，該方法簡便可靠、準(zhǔn)確易行，可為夏枯草口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供實驗依據(jù)。