糖通飲含藥血清對高糖培養(yǎng)HBZY-1細胞microRNA-21、Smad7以及α-SMA表達的影響*

伏紅穎，潘艷伶，陳俞如，陳洪民

(1.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院 中醫(yī)學教研室，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 中醫(yī)科，貴州 貴陽 550000)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，已經(jīng)成為引起終末期腎病的主要原因之一，嚴重威脅人類健康。腎小球系膜細胞是腎小球的固有細胞，具有收縮、吞噬、增殖、分泌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、產(chǎn)生細胞因子以及生長因子的作用，系膜細胞的增殖以及ECM的積聚是導致DKD腎纖維化的重要因素[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)與腎小球系膜細胞的增殖和ECM積聚密切相關[2]；高糖狀態(tài)下過表達的microRNA-21(miR-21)可促進ECM增多，加快腎纖維化進程[3]；而作為miR-21靶基因的Smad7[4]，其表達被抑制，也會促進腎纖維化的進程[5]。本課題組在前期動物及臨床實驗研究中發(fā)現(xiàn)，臨床經(jīng)驗方糖通飲可降低早期DKD大鼠24 h尿蛋白水平，保護DKD大鼠腎組織，延緩DKD進展，且在臨床使用中療效顯著[6-7]。推測糖通飲可能通過抑制miR-21和α-SMA的表達、升高Smad7表達達到抑制高糖狀態(tài)下系膜細胞增殖的作用，本實驗觀察高糖環(huán)境下糖通飲中藥血清對HBZY-1細胞增殖以及對miR-21、Smad7、α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)因子的影響，從細胞層面進一步探尋糖通飲延緩DKD進展的可能靶點，為糖通飲的臨床使用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 30只SPF級雄性SD大鼠，體質量(180±20) g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2020-0001,動物實驗設計嚴格經(jīng)過貴州醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院倫理委員會審查(審批編號2000575)，實驗動物使用許可證號SYXK(黔)2018-0001。大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1(批號HTX1809)，購自深圳Otwo Biotech公司。

1.1.2藥物 糖通飲顆粒制劑，由廣東一方制藥有限公司提供，組成藥物為生地3.6 g(相當于12 g生藥飲片)、山藥0.75 g(相當于15 g生藥飲片)、山茱萸2.5 g(相當于10 g生藥飲片)、茯苓0.75 g(相當于15 g生藥飲片)、澤瀉0.9 g(相當于9 g生藥飲片)、丹皮2 g(相當于12 g生藥飲片)、黃芪4 g(相當于20 g生藥飲片)、丹參2.7 g(相當于15 g生藥飲片)、地骨皮0.75 g(相當于15 g生藥飲片)、草決明3 g(相當于15 g生藥飲片)。一付生藥138 g等于糖通飲顆粒劑20.95 g；將糖通飲顆粒劑20.95 g溶入飲用水138 mL中，生藥濃度為1 g/mL。

1.1.3主要試劑 抗Smad7抗體(批號ab216428)和抗α-SMA抗體(批號ab7817)購自abcam公司，抗GAPDH 抗體(批號HRP-60004)、山羊抗兔IgG-HRP二抗(批號M21002S)購自proteintech公司，胰酶細胞消化液(批號25200-056)、DMEM培養(yǎng)基(批號C11885500BT，5.5 mmol/L glucose)由Gibco Introvagen公司提供，青鏈霉素雙抗(批號SV30010)由HyClone公司提供，Opti-MEM(批號31985-070)購自Gibco公司，Lipofectamine 2000(批號11668027)購自Invitrogen公司，特級胎牛血清(南美，批號04-001-1ACS)由BI公司提供，cDNA合成試劑盒(批號K1622)購自thermo公司,PCR逆轉錄試劑盒(批號HB190916)、SYBR(批號HB210322)購自上海翊圣生物科技有限公司，miR-21的q-pcr試劑盒(批號C10712-1)購自銳博公司，CCK-8試劑盒(批號K1018)購自APExBIO公司。

1.1.4主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國thermo公司)、超凈工作臺(蘇州凈化)、倒置顯微鏡(德國 Leica 公司)、實時熒光定量PCR儀C1000(美國 BIO-RAD 公司)、凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 細胞鑒定后，選取第3～15代細胞在體積分數(shù)為10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中(包含F(xiàn)BS、青鏈霉素和5.5 mmol/L葡萄糖DMEM)培養(yǎng)，待細胞融合度達80%～90%時進行傳代，細胞置于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2.2含藥血清的制備 30只SPF級雄性SD大鼠，隨機分為空白對照組和糖通飲組，每組15只；糖通飲生藥濃度為1 g/mL，按照人體-大鼠體表面積比值換算，以12.4 g/(kg·d)灌胃給藥,空白對照組給予等體積的雙蒸水，兩組均連續(xù)灌胃7 d；末次灌胃1 h后，分別經(jīng)股動脈取血，血樣靜置2 h后，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，分離血清后分裝放入1.5 mL EP管，做好標記，并置于60 ℃水浴30 min，滅活補體，在超凈工作臺過濾除菌后，凍存于-80 ℃[8]。

1.2.3不同濃度含藥血清DMEM培養(yǎng)基配置 以高糖+低濃度糖通飲含藥血清培養(yǎng)基(30 mmol/L葡萄糖+體積分數(shù)5%糖通飲含藥血清)50 mL的配比為例：稱取 0.220 7g 的葡萄糖充分溶于 47.5 mL 的正常糖培養(yǎng)液中，在超凈工作臺用過濾器過濾后，加入2.5 mL糖通飲含藥血清，顛倒混勻后分裝于5 mL離心管中，充分混勻后于-20 ℃或者4 ℃儲存。中、高濃度糖通飲含藥血清培養(yǎng)基配比方法同高糖+低濃度糖通飲含藥血清培養(yǎng)基配比，糖通飲含藥血清和DMEM所取體積按對應比例。

1.2.4CCK-8法篩選最佳濃度中藥血清 系膜細胞計數(shù)后，將細胞以3×104/mL 接種于96 孔板中，細胞貼壁后，用無血清正常糖DMEM培養(yǎng)液同步化細胞24 h，同時設立正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、高糖+低、中、高濃度糖通飲含藥血清組(30 mmol/L葡萄糖)共5個組，每組6個復孔(低、中、高濃度組的中藥血清濃度體積分數(shù)分別為5%、10%以及15%糖通飲大鼠血清[9])，按分組給予相應體積分數(shù)糖通飲含藥血清干預。培養(yǎng)48 h后，每孔加入0.5%的CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測各孔在波長450 nm處吸光值，同時設置空白組和對照組。計算細胞增殖率，細胞增殖率=[(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%，以確定最佳濃度糖通飲含藥血清，并將這一濃度用于后續(xù)實驗中。

1.2.5CCK-8法檢測實驗各組HBZY-1細胞增殖情況 檢測方法同1.2.4，篩選出最佳濃度糖通飲含藥血清后，將細胞共分為正常糖+空白血清組(5.5 mmol/L葡萄糖+10%空白血清組大鼠血清)、高糖+空白血清組(30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清組大鼠血清)、高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組[30 mmol/L葡萄糖+10%糖通飲組大鼠血清(1.2.4實驗篩選出的最佳濃度血清)]，每組6個復孔。

1.2.6實時熒光定量PCR法檢測各組細胞miR-21表達，以及Smad7、α-SMA的mRNA表達 收集培養(yǎng)的各組細胞，按Trizol說明書提取細胞總RNA。根據(jù)廣州銳博的miRNA逆轉錄試劑盒和miRNA q-PCR試劑盒說明書檢測miR-21的表達，以U6作為內參(miR-21和U6的引物均由廣州銳博公司設計)。根據(jù)上海翊圣公司反轉錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉錄為cDNA，按熒光定量PCR試劑盒檢測Smad7、α-SMAmRNA表達，以GAPDH作為內參；引物序列Smad7為 F-5′-GAGGCTACTGTGTCCAAGA-3′、R-5′-TGTTGTCCGAATTGAGCTGTC-3′(95 bp)，α-SMA為F-5′-AGCGTGGCTATTCCTTCGT-3′、R-5′-CTCATTTTCAAAGTCCAGAGCTACA-3′(95 bp)，內參照GAPDH為F-5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′、R-5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′(92 bp)。2-ΔΔCt計算各組基因相對表達量，并進行統(tǒng)計分析。

1.2.7Western blot法檢測各組細胞Smad7、α-SMA的蛋白表達 將培養(yǎng)結束的六孔板拿出，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，加入含PMSF的裂解液，于冰上裂解40 min后收集到標記好的EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，將上清液吸入新的EP管，按4 ∶1(裂解液 ∶5×Buffer)的比例加入5×Buffer，震蕩混勻，煮沸后經(jīng)過10%SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，50 g/L脫脂牛奶封閉，TBST洗膜后，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光后，以GAPDH 為內參，對PVDF膜的顯影條帶進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HBZY-1細胞生長狀態(tài)

大鼠HBZY-1細胞傳代24 h后，即可貼壁，貼壁后經(jīng)倒置顯微鏡觀察顯示，細胞呈星狀或梭形，生長狀態(tài)較好，可進行藥物干預。見圖1。

注：A為細胞貼壁24 h，B為細胞貼壁48 h。圖1 HBZY-1細胞生長狀態(tài)(5.5 mmol/L葡萄糖，×40)Fig.1 Growth status of HBZY-1 cells (5.5 mmol/L glucose,×40)

2.2 不同濃度中藥血清組細胞增殖情況

結果顯示，與正常糖組相比，高糖組細胞增殖率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖組相比較，低、中、高濃度糖通飲含藥血清組細胞增殖率均降低，差異有統(tǒng)計學意義(F=15.3，P<0.05)；中、高濃度糖通飲含藥血清組間細胞增殖率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。因此，后續(xù)實驗選擇中濃度糖通飲含藥血清作為處理因素。見表1。

表1 不同濃度中藥血清組細胞增殖情況(n=3)Tab.1 Cell proliferation in serum groups with different concentrations of traditional Chinese medicine(n=3)

2.3 HBZY-1細胞增殖情況

結果顯示，與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組細胞明顯增殖，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比較，高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組細胞增殖增殖率均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；提示糖通飲含藥血清可減輕HBZY-1細胞的增殖。見圖2。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖2 各組HBZY-1細胞的增殖情況(CCK-8，n=3)Fig.2 Cell proliferation in each experimental group(CCK-8，n=3)

2.4 HBZY-1細胞miR-21的表達以及Smad7、α-SMA mRNA表達

結果顯示，與正常糖+空白血清組比較，高糖+空白血清組HBZY-1細胞的miR-21表達和α-SMAmRNA表達升高，Smad7 mRNA表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組細胞相比，高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組HBZY-1細胞的miR-21 表達和α-SMAmRNA表達降低 ，Smad7 mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖3 各組HBZY-1細胞miR-21表達以及Smad7、α-SMA mRNA表達(n=3)Fig.3 Comparison of expression of miR-21,Smad7,andα-SMA mRNA in HBZY-1 cells of each group(n=3)

2.5 HBZY-1細胞Smad7、α-SMA蛋白的表達

與正常糖+空白血清組比較，高糖+空白血清組HBZY-1細胞的Smad7蛋白表達降低，α-SMA蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組HBZY-1細胞相比，高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組HBZY-1細胞的Smad7蛋白表達增加，α-SMA蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Smad7、α-SMA、GAPDH蛋白Western blot 灰度值，B為Smad7/GAPDH、α-SMA/GAPDH蛋白直條圖；(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖4 各組HBZY-1細胞Smad7和α-SMA蛋白的表達(n=3)Fig.4 Protein expression of Smad7 and α-SMA in HBZY-1 cells of each group(n=3)

3 討論

腎纖維化是DKD的主要病理改變之一，它的形成涉及系膜細胞的增殖和腎小球ECM增多等[10]。腎系膜細胞是一類包繞微血管或毛細血管的特殊的平滑肌細胞，占腎小球固有細胞總數(shù)的30%～40%，可以提供腎小球的結構支撐，調控腎小球的濾過功能。在生長因子、炎癥因子、晚期糖基化終產(chǎn)物等因素刺激下系膜細胞過度分泌ECM，使ECM合成及降解失衡。系膜細胞發(fā)生肌成纖維細胞轉分化(myofibroblastic transdifferentiation，MFT)也參與內皮及足細胞損傷和繼發(fā)的小管間質損傷過程。因此腎系膜細胞在腎臟纖維化病灶的形成中具有重要作用[11-12]。α-SMA是系膜細胞發(fā)生肌成纖維細胞轉分化MFT的重要標志物，在腎纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用，α-SMA不僅促進腎小球系膜細胞增殖，同時通過多個作用環(huán)節(jié)導致ECM過度聚積，引起腎小球系膜區(qū)擴張、毛細血管基底膜增厚，導致彌漫性或結節(jié)性腎小球硬化和腎纖維化，從而成為DKD的關鍵病理特征[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖可以升高HBZY-1細胞中α-SMA的表達，促進HBZY-1細胞的增殖。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)microRNA也參與了DKD的發(fā)生發(fā)展，該家族中的miR-21是調控代謝、炎癥及纖維化的重要分子，普遍存在于腎臟纖維化疾病[15-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，在DKD發(fā)展過程中，miR-21可直接作用于靶基因Smad7的3′-UTR部位，并且抑制其表達，從而促進DKD腎纖維化的進程[18-21]。本實驗結果顯示，高糖能使HBZY-1細胞內miR-21表達明顯增加。

在中醫(yī)學中，DKD按臨床表現(xiàn)屬于消渴并虛勞、腎勞、水腫等范疇，其基本病機為氣陰兩虛為本、痰瘀濁毒阻絡為標[22]。根據(jù)DKD這一基本病機特點創(chuàng)制的中醫(yī)復方糖通飲，是在六味地黃丸的基礎上改熟地黃為生地黃，并配伍黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成，既培補肝腎、調養(yǎng)氣陰，又除標實之痰濁、通腎絡之瘀阻[23]。根據(jù)現(xiàn)代藥理學研究證實，黃芪具有預防腎臟系膜細胞早期增殖及糖基化終產(chǎn)物介導的細胞凋亡的作用[24]；丹參對腎臟具有抗腎纖維化、減輕腎臟細胞損害的作用[25]。本實驗結果顯示，糖通飲中藥血清能降低HBZY-1細胞內miR-21 表達，增加Smad7 mRNA和蛋白的表達，降低α-SMA mRNA和蛋白表達，從而抑制HBZY-1細胞的增殖。表明糖通飲中藥血清可以抑制HBZY-1細胞增殖、減少ECM沉積，其作用機制可能與調節(jié)miR-21、Smad7以及α-SMA的表達有關，本研究找到了糖通飲防治DKD的新靶點，為經(jīng)驗方糖通飲的臨床應用提供新的理論依據(jù)。