白藜蘆醇對阿爾茨海默病小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達(dá)及Tau蛋白磷酸化水平的影響*

康小紅，王藝明*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 精神科，貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默病(Alzheimer's desease，AD)是以進(jìn)行性記憶損傷和認(rèn)知障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經(jīng)退行性疾病[1-3]，在海馬、前額葉皮質(zhì)等處沉積于神經(jīng)元細(xì)胞周圍的β-淀粉樣蛋白(amyloid beta，Aβ)可引起膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)炎癥等，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白-Tau蛋白過度磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)[4]，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和突觸性壞死，最終引發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)精神癥狀[5-8]。研究表明，白藜蘆醇(resveratrol，Res)可激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶I(silencing information regulator 2 related enzyme Ⅰ，SIRT1)，再經(jīng)維甲緯酸受體β(retinoic acid receptor beta，RARβ)間接或直接激活含有解整合素和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白10(a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10，ADAM10)，減少Aβ的產(chǎn)生[9]，但Res能否通過上調(diào)SIRT1/RARβ/ADAM10信號通路表達(dá)降低Tau蛋白磷酸化水平的報道尚未見到。因此，本研究擬通過SIRT1受體唯一激動劑Res干預(yù)AD模型小鼠，觀察小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達(dá)水平及Tau蛋白絲氨酸396位點[phosphorylated Tau Ser396，p-tau(S396)]磷酸化水平，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物來源 選取6月齡C57BL/6雄性小鼠6只，6月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠12只，均購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK(蘇)2018-0008]。

1.1.2主要儀器 動物通用活動箱(上海吉量)，臺式高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter)，超聲波細(xì)胞/組織破碎儀(上海利聞)，生物安全柜和分光光度計NanoPhotometer?(美國Thermo Fisher Scientific)，7500聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因擴增儀和普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀(美國ABI)，多功能酶標(biāo)儀和小型垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad)，化學(xué)發(fā)光成像儀(上海勤翔)。

1.1.3主要藥物和試劑 Res粉末(西安格林)，TRIZOL RNA提取液(美國賽默飛)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TAKARA)，引物(上海生物)，高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、彩虹marker、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)蛋白加樣緩沖液(5×)及SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(北京索萊寶)，2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天)，Tau phospho S396單克隆抗體和Tau蛋白單克隆抗體(英國Abcam)，SIRT1、ADAM10/MADM、RAR β及β-actin多克隆抗體(北京博奧森)。

1.2 研究方法

1.2.1實驗動物造模和分組 C57BL/6小鼠設(shè)為空白對照組(blank control，BC組)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠參考文獻(xiàn)[10]制備的AD小鼠模型隨機均分為AD組和AD+Res組；稱取Res粉末32 mg，加生理鹽水3.9 mL，再加二甲基亞砜0.1 mL混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，每日于同一時間對AD+Res組小鼠予800 mg/kg Res溶液灌胃3個月，其余組小鼠予相應(yīng)量生理鹽水灌胃3個月。

1.2.2Morris水迷宮實驗(morris water maze,MWM) 取直徑40 cm的圓柱體玻璃水缸，加25 ℃清潔水至25 cm，中央放置一個高于水面5 cm的平臺，將各組小鼠依次放入水缸，引導(dǎo)小鼠找到水中平臺，訓(xùn)練4次/d、共4 d；訓(xùn)練結(jié)束后將小鼠從原來進(jìn)入水缸位置的對側(cè)放入水缸，記錄小鼠在非引導(dǎo)狀態(tài)下找到水中平臺的時間，以測試小鼠的學(xué)習(xí)、記憶及空間探索能力，即認(rèn)知能力[11]。所有小鼠9月齡時再次測試，第2次MWM前不再進(jìn)行訓(xùn)練。MWM期間各組小鼠飼養(yǎng)于溫度21 ℃、濕度50%的適宜環(huán)境，自由進(jìn)食，每組3只小鼠分籠飼養(yǎng)。

1.2.3熒光實時定量PCR(real-time fluorescent PCR，RT-qPCR)檢測小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1、ADAM10 mRNA表達(dá)水平 各組小鼠于9月齡再次完成MWM后適時麻醉處死，冰上快速取腦，分離出前額葉皮質(zhì)，稱取前額葉皮質(zhì)5 mg，Trazol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA，再按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒操作說明書進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列及目的片段大小Tab.1 RT-qPCR primer sequence and target fragment size

1.2.4免疫蛋白印跡(Western blot)檢測小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達(dá)及Tau蛋白磷酸化水平 將高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑PMSF以100 ∶1 ∶1配置裂解液，稱取各組小鼠前額葉組織10 mg，加裂解液200 μL，超聲研磨均勻，冰上裂解30 min、混勻1次/5min，14 000 r/min于4 ℃離心15 min。吸取上清液后按照BCA蛋白濃度測定試劑盒操作說明書測定總蛋白濃度，剩余樣品與5×SDS-PAGE蛋白加樣緩沖液以4 ∶1混合均勻后100 ℃加熱5 min。以每孔定量蛋白樣品30 μg進(jìn)行電泳，90 V恒壓電泳30 min，120 V恒壓電泳1.5 h，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%牛奶或BSA封閉液封閉1 h，相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，次日進(jìn)行二抗孵育、洗膜及曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MWM

與同組6月齡比較，9月齡AD組和AD+Res組小鼠找到水中平臺的時間均明顯延長(P<0.01)，BC組小鼠6月齡時與9月齡時MWM指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與9月齡BC組比較，AD組小鼠找到平臺的時間明顯延長(P<0.01)，但AD+Res組小鼠與AD組組間差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠MWM中找到水中平臺的時間Tab.2 Time to find water platform in MWM of mice in each

2.2 SIRT1和ADAM10 mRNA表達(dá)

與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1和ADAM10 mRNA表達(dá)均下降(P<0.01)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質(zhì)ADAM10 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.01)，但SIRT1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠前額葉組織SIRT1和ADAM10 mRNA的表達(dá)Tab.3 SIRT1 and ADAM10 mRNA expression

2.3 SIRT1、RARβ、ADAM10蛋白表達(dá)及p-tau(S396)水平

與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1、ADAM10蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT1、ADAM10表達(dá)水平升高(P<0.05)。與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質(zhì)RARβ表達(dá)水平降低(P<0.05)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質(zhì)RARβ表達(dá)水平升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與BC組比較，AD組小鼠前額葉皮質(zhì)p-tau(S396)磷酸化水平升高(P<0.001)；與AD組比較，AD+Res組小鼠前額葉皮質(zhì)p-tau(S396)磷酸化水平降低(P<0.01)。見圖1。

注：A為免疫印跡條帶，B～E分別為SIRT1蛋白、RARβ蛋白、ADAM10蛋白及p-tau(S396)磷酸化定量結(jié)果；(1)與BC組比較，P<0.01；(2)與AD組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠前額葉皮質(zhì)SIRT信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和p-tau(S396)磷酸化水平Fig.1 Expression of SIRT signaling pathway related proteins and phosphorylation level of p-tau (S396) in prefrontal cortex of mice in each group

3 討論

有研究報道，6～7月齡的APP/PS1小鼠腦內(nèi)Aβ開始沉積并逐漸形成老年斑[12]。因此本研究采用6月齡小鼠作為研究對象，通過對比BC組、AD組、AD+Res組小鼠前額葉皮質(zhì)處的p-tau(S396)磷酸化程度和認(rèn)知水平的改變，評估AD小鼠和經(jīng)Res治療后的AD小鼠前額葉神經(jīng)纖維纏結(jié)程度以及與SIRT1/RARβ/ADAM10信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)性。

MWM是常見的用于評估神經(jīng)、精神疾病模型動物認(rèn)知功能的實驗方法，通過觀察小鼠訓(xùn)練后找到水中平臺的時間評估小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力及空間探索能力，也可在一定程度上反映實驗小鼠的行為活動能力[13]。本研究中，BC組小鼠在6月齡和9月齡時的MWM測試中，找到平臺的時間無差異，而AD組小鼠與AD+Res組小鼠則在9月齡時表現(xiàn)出搜索潛伏期明顯延長、直游及圈游次數(shù)減少，迷宮周邊停留時間顯著增加，表明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因處理所導(dǎo)致的小鼠大腦病理改變損害了小鼠的認(rèn)知能力以及運動功能，同時，經(jīng)Res干預(yù)的小鼠與同月齡BC組和AD組小鼠組間比較MWM測試時間均無差異，由此推測Res干預(yù)可能在一定程度上改善了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因處理所導(dǎo)致的認(rèn)知損害，對AD的認(rèn)知能力以及運動功能下降有一定治療作用但并不能完全緩解，這與前期相關(guān)研究報道結(jié)果一致[14-15]。因此，本課題將在后續(xù)研究中擴大樣本量，應(yīng)用更加全面的認(rèn)知能力與運動功能的測試方法，進(jìn)一步深入探究Res干預(yù)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的效果評價。

關(guān)于AD發(fā)生發(fā)展的機制雖然尚未研究清楚，但Aβ級聯(lián)假說與Tau蛋白過度磷酸化假說卻得到了相當(dāng)一部分研究成果的支持，證明Aβ可以誘導(dǎo)Tau蛋白的過度磷酸化，進(jìn)而引起中樞神經(jīng)纖維扭曲、纏結(jié)[16-19]。Aβ代謝分為有β-分泌酶和γ-分泌酶參與的淀粉樣代謝途徑和有α-分泌酶參與的非淀粉樣代謝途徑，β淀粉樣前體蛋白可被蛋白水解作用產(chǎn)生Aβ，起到神經(jīng)毒性作用，Aβ分布于大腦多個皮質(zhì)層區(qū)域，以海馬、額顳葉等處尤其明顯，α-分泌酶ADAM10則參與β淀粉樣前體蛋白的非淀粉樣代謝途徑，產(chǎn)生可溶性片段sAPPa，競爭性降低Aβ水平，sAPPa在一定范圍內(nèi)的升高有利于神經(jīng)保護(hù)作用[20-25]。

SIRT1可直接激活A(yù)DAM10，也可通過RARβ間接地增加ADAM10的表達(dá)，減少毒性Aβ的生成與沉積，由此推測Res激活SIRT1也可減輕小鼠前額葉皮質(zhì)Tau蛋白磷酸化水平，并改善小鼠的認(rèn)知功能、探索能力、活動能力及記憶力[26]。本研究中，在基因水平，SIRT1、ADAM10在AD組小鼠表達(dá)較BC組降低，SIRT1在AD+Res組與AD組無差異，AD+Res組小鼠ADAM10表達(dá)高于AD組。在蛋白水平，APP/PS1轉(zhuǎn)基因使AD組小鼠SIRT1、RARβ、ADAM10水平均低于BC組，并且AD組小鼠Tau蛋白磷酸化程度明顯高于BC組，Res處理則使上述信號通路上調(diào)，并且降低Tau蛋白磷酸化程度，說明AD發(fā)生發(fā)展的機制之一可能是該信號通路的下調(diào)。最終本研究證明，AD小鼠的SIRT1/RARβ/ADAM10信號通路下調(diào)，Tau蛋白磷酸化水平升高，Res則上調(diào)了上述信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，降低了小鼠前額葉皮質(zhì)Tau蛋白的磷酸化水平，改善了實驗小鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，AD 小鼠前額葉信號通路中SIRT1、RARβ及ADAM10表達(dá)降低，Tau蛋白磷酸化程度升高；Res可改善AD小鼠認(rèn)知功能，與AD小鼠前額葉SIRT1、RARβ、ADAM10表達(dá)上調(diào)及Tau蛋白磷酸化程度降低有關(guān)。