骨康膠囊組分酢漿草和芭蕉根對家兔骨折愈合的作用及機制*

唐銀彤，楊健，李靖，王永林，李勇軍，楊暢，孫佳，劉春花，劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；3.貴州省食品藥品檢驗所 保健食品化妝品檢測室，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

骨折(fracture)指骨或軟骨連續(xù)性或完整性發(fā)生完全性或不完全性的中斷，多發(fā)于老年人群體，是常見的臨床疾病之一[1-2]。骨折愈合是極為漫長的修復(fù)過程，對患者的治療成本和生活質(zhì)量都有著重大影響[3-4]。研究表明，骨康膠囊可加速骨折愈合速度，促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收、調(diào)節(jié)骨代謝、提高骨密度及促進(jìn)骨折的愈合，但是其機制尚不清楚[5-8]。骨康膠囊由酢漿草、芭蕉根、補骨脂、續(xù)斷及三七等組成，其中酢漿草、芭蕉根為君藥，補骨脂、續(xù)斷為臣藥，三七為佐藥[9-10]。酢漿草具清熱利濕、涼血散瘀等功效，有研究表明酢漿草水提物在體外可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化，在臨床上對扭傷及骨折愈合有顯著療效[11]；芭蕉根具清熱解毒、抗炎止痛等功效，常用于治療骨質(zhì)疏松、骨折等疾病，在臨床上發(fā)揮了較好的治療作用[12]。目前，酢漿草和芭蕉根已有相關(guān)的臨床研究及體外研究[13-14]，但尚未見酢漿草及芭蕉根對骨折愈合的體內(nèi)作用機制的相關(guān)報道。因此，為進(jìn)一步了解骨康膠囊療效并闡明其作用機理，本研究利用家兔橈骨骨折模型，探討骨康膠囊組分酢漿草、芭蕉根對家兔血液流變性、血清鈣(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量，并結(jié)合骨折部位的病理學(xué)檢查闡明其治療作用，為骨康膠囊進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 4月齡雄性健康家兔35只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供[合格證號SCXK (渝) 2012-0003]；家兔飼養(yǎng)于濕度40%～70%、溫度20～25 ℃的環(huán)境中，實驗前動物適應(yīng)環(huán)境7 d。

1.1.2主要藥品與試劑 接骨七厘片(規(guī)格0.3 g生藥量/片，湖南金沙藥業(yè))，酢漿草及芭蕉根藥材(貴州維康子帆藥業(yè))；ALP、P及Ca試劑盒(南京建成生物)。

1.1.3主要儀器 施力特P500-12型電鉆(寧波易睞軻)，超純水機(四川沃特爾)，EL204電子天平(上海梅特勒-托利多)，自動血液流變儀LBY-N6K(北京普利生)，DH6000BII型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特)，Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀、Thermo fresco 17低溫高速離心機(美國 Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模、分組及取樣 35只家兔隨機分為正常組、模型組、接骨七厘片組、酢漿草組及芭蕉根組，每組7只。正常組家兔給予蒸餾水灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續(xù)30 d。后4組家兔參照文獻(xiàn)方法[27]造模，予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，固定于手術(shù)臺，常規(guī)左前肢剪毛、消毒、切開皮膚，分離周圍肌肉、軟組織及血管，暴露橈骨、小型電鋸制作骨折模型，造成左上肢橈骨中段3 mm的完全缺損，尺骨保持完整，切口滴青霉素4萬單位，止血、逐層縫合皮膚后包扎、不用石膏夾板固定，術(shù)后3 d青霉素40萬單位肌肉注射、1次/d。造模后第4天開始灌胃給藥，正常組、模型組家兔予蒸餾水灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續(xù)30 d；接骨七厘片組(0.140 g生藥/kg)、酢漿草組(0.224 g生藥/kg)及芭蕉根組(0.336 g生藥/kg)家兔予各處理藥物與蒸餾水調(diào)成的混懸液按體質(zhì)量10 mL/kg灌胃，1次/d，連續(xù)30 d；各組家兔末次給藥24 h后，固定于手術(shù)臺，剪去心臟部位被毛，75%酒精消毒家兔皮膚，選擇心搏最明顯處穿刺，針頭刺入心臟取得所需血量，拔出針頭，采用耳緣靜脈注射空氣的方式處死家兔，剝離左側(cè)橈骨，10%甲醛溶液固定，待后續(xù)實驗備用。

1.2.2血清ALP、Ca及P含量的測定 取1.2.1項下各組家兔心臟血3 mL，于4 ℃冰箱靜置2 h，待血液凝固；3 000 r/ min離心10 min，取血清，置于-80 ℃冷凍備用；后續(xù)實驗按ALP、Ca及P試劑盒說明書進(jìn)行測定，計算各組家兔血清ALP、Ca及P的含量。

1.2.3血液流變性參數(shù)的測定 取1.2.1項下各組家兔心臟血5 mL，采用自動血液流變儀檢測全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積及血沉等血流變性參數(shù)。

1.2.4骨折病理檢測 取1.2.1項下各組家兔左側(cè)橈骨，于骨折部位上下各1 cm處鋸斷，剔除骨骼肌、軟組織，置于10%甲醛溶液固定；取固定好的骨組織于混合酸脫鈣液(蒸餾水800 mL、鹽酸100 mL及甲酸100 mL)中脫鈣1周，以大頭針能輕易刺入骨組織即為脫鈣完成；常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)法染色后，標(biāo)本置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清ALP、Ca及P水平

結(jié)果顯示，模型組家兔血清ALP、P水平較正常組明顯下降(P<0.01)，接骨七厘片組家兔血清ALP、P水平較模型組明顯升高(P<0.01)；酢漿草組、芭蕉根組家兔血清ALP水平較模型組明顯升高，但Ca、P水平無變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組家兔血清ALP、Ca及P的水平Tab.1 Levels of serum ALP,Ca,and P in rabbits of each

2.2 血液流變學(xué)參數(shù)

血液流變學(xué)檢查結(jié)果顯示，模型組家兔全血全血黏度、血沉較正常組明顯升高(P<0.01)，接骨七厘片組家兔全血黏度、血沉較模型組明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，酢漿草組和芭蕉根組家兔全血中切、高切黏度降低(P<0.05或P<0.01)，但血漿黏度、紅細(xì)胞壓積與血沉比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組家兔的血液流變學(xué)參數(shù)Tab.2 Rheology parameters of rabbits in each

2.3 骨折部位組織學(xué)特征

結(jié)果顯示，正常組家兔可見正常的骨組織結(jié)構(gòu)；模型組家兔可見斷骨端骨小梁纖細(xì)、稀疏，仍為纖維性組織連接，可見極少數(shù)成骨細(xì)胞；接骨七厘片組、酢漿草組及芭蕉根組家兔可見較多大量纖維組織和成骨細(xì)胞，斷端和骨膜下有較多的類骨質(zhì)出現(xiàn)。見圖1。

圖1 各組家兔骨折部位的組織學(xué)特征(HE，×400)Fig.1 Histological feature of fracture sites in rabbits of each group(HE，×400)

3 討論

骨折愈合是一個復(fù)雜的多級修復(fù)過程，涉及骨骼對細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號分子的感應(yīng)和傳導(dǎo)，其機制十分復(fù)雜，受年齡、力學(xué)環(huán)境及局部血液供應(yīng)等多種因素的影響[15-16]。骨折修復(fù)過程中，成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成纖維細(xì)胞分別合成、分泌骨基質(zhì)，隨后鈣鹽能夠?qū)⑵涑练e并形成骨組織。在骨折愈合中，血Ca一般和血P共同發(fā)揮作用，骨、血液中的Ca、P相互轉(zhuǎn)移，呈現(xiàn)一種動態(tài)平衡[17]。ALP是一種分布于細(xì)胞膜的鈣結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白，主要由肝臟、腎上腺、骨骼等合成[18]。ALP可促進(jìn)細(xì)胞成熟、鈣化并滲入血液中，使血液中的ALP含量增加，促進(jìn)前成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化，從而加快骨折愈合[19-21]。本研究顯示，給藥30 d后，家兔血清ALP水平結(jié)果表明，酢漿草組、芭蕉根組的ALP含量較模型組上調(diào)，但Ca、P水平無變化(P>0.05)，提示酢漿草、芭蕉根可通過提高ALP含量，從而促進(jìn)骨折愈合。

當(dāng)機體發(fā)生骨折創(chuàng)傷后，血流速度減慢，血漿黏度增加，其可能與局部血管損傷形成血腫有關(guān)[22-23]；也可能是體內(nèi)兒茶酚胺的分泌量增加，全身血管收縮，肢體血流量下降，血流緩慢，組織產(chǎn)生缺血、缺氧、乳酸蓄積及自由基大量產(chǎn)生，引起血液粘稠度增加，從而導(dǎo)致血液循環(huán)異常，抑制骨折愈合[24-25]。骨折后血液濃、黏、聚、凝性顯著增高,其程度可用血液流變學(xué)指標(biāo)來反映,各指標(biāo)之間并不是孤立的,而是有著密切的聯(lián)系，在生理上相互依存,病理上相互影響。紅細(xì)胞壓積是影響血液黏度的最主要因素，血漿黏度反映了血液的粘滯性和濃稠性,影響組織血流灌注甚至形成血栓；血沉是反映血液聚集性的指標(biāo)；全血低切變率黏度值反映紅細(xì)胞的聚集程度；全血高切變率黏度值反映紅細(xì)胞的變形程度；中切黏度值為低切到高切黏度變化的過渡點[26]。骨折早中晚期均表現(xiàn)為血液粘稠度增加，以早期較為明顯，其變化不僅發(fā)生在骨折局部，而且全身表現(xiàn)出瘀血特征[27]。本研究血液流變性結(jié)果顯示，給藥30 d后，與模型組比較，酢漿草、芭蕉根降低家兔全血中切、高切黏度，從而加快血流速度，降低家兔血漿黏度，改善血液流變性，紅細(xì)胞壓積與血沉無變化,表明酢漿草、芭蕉根能促進(jìn)骨折愈合。

在骨折愈合過程中，骨吸收和骨形成過程是破骨細(xì)胞吸收舊骨和成骨細(xì)胞形成新骨的過程，二者緊密聯(lián)系共同完成骨的重建[28]。通過骨代謝指標(biāo)含量測定可有效地反映骨折愈合過程中的骨代謝情況[29]。本研究病理學(xué)特征結(jié)果顯示，與模型組比較，酢漿草組和芭蕉根組家兔骨折部位可見大量纖維組織、成骨細(xì)胞，斷端和骨膜下出現(xiàn)較多類骨質(zhì)，提示酢漿草、芭蕉根可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖而加速骨折愈合過程。

綜上所述，酢漿草、芭蕉根可通過上調(diào)家兔ALP，降低其全血中切、高切黏度，改善血液流變性，從而促進(jìn)家兔骨折愈合，提示酢漿草、芭蕉根在骨康膠囊治療骨折過程中具有重要作用。