雙歧桿菌對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝的影響

石 英，拉巴普尺，張丹瑛，翁書(shū)強(qiáng)*，劉心怡，汪皓琪*

1.奉賢區(qū)中醫(yī)醫(yī)院消化科，上海 201400

2.日喀則市人民醫(yī)院消化科，日喀則 857000

3.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科，上海 200032

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是慢性肝病的首要病因［1］，在肥胖人群中，NAFLD發(fā)病率可高達(dá)75%，在全球范圍內(nèi)NAFLD人群所占比例達(dá)15%～30%［2］。隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行趨勢(shì)，該病在我國(guó)患病率逐年升高。如何預(yù)防和治療NAFLD是近年來(lái)大量研究者的關(guān)注熱點(diǎn)之一［3］。

腸道微生物對(duì)人體的健康起到了至關(guān)重要的作用［4-6］。不僅基礎(chǔ)狀態(tài)下腸道菌群的組成與疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，腸道菌群的失衡與消化疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生密切相關(guān)［7-8］。腸道微生態(tài)與NAFLD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Buchman等［9］發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)狀態(tài)下，變形菌門(mén)（尤其是Gamma變形菌亞類(lèi)）含量較高，與發(fā)生脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)較低相關(guān)，而基礎(chǔ)狀態(tài)下丹毒絲菌綱（硬壁菌門(mén)的成員）含量較高與脂肪肝的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。與單純性脂肪變性患者和健康對(duì)照者相比，非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）患者的擬桿菌門(mén)數(shù)量顯著降低，對(duì)體質(zhì)指數(shù)（BMI）進(jìn)行校正后也如此。同時(shí)，與單純性脂肪變性組相比，NASH患者的毛螺旋菌科種數(shù)量增加，然而在對(duì)BMI和脂肪攝入量進(jìn)行校正后，這種差異的顯著性喪失［10］。相比對(duì)照組，NASH和肥胖患者中觀察到硬壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)數(shù)量降低，但NASH患者和肥胖患者的擬桿菌門(mén)和硬壁菌門(mén)的豐度相似。NASH組中大腸桿菌的增加可能導(dǎo)致乙醇水平升高，因?yàn)檫@些微生物能夠產(chǎn)生乙醇［11］。Zhang等［12］發(fā)現(xiàn)，NASH患者的腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯低于對(duì)照組，而腸桿菌和腸球菌病原菌數(shù)量明顯高于對(duì)照組。

近年來(lái)，基因組學(xué)和代謝組學(xué)的發(fā)展為調(diào)節(jié)腸道菌群防治NAFLD的思路提供了可行性［13-14］。因此，利用基因、代謝組學(xué)的分析方法，從中突破尋求NAFLD防治新方案值得深入。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕57BL/6小鼠32只，8 周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。置于12 h的光照下循環(huán)和溫度控制的環(huán)境。于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部SPF級(jí)飼養(yǎng)。動(dòng)物飼養(yǎng)溫度（22±2）℃。通過(guò)西方高脂飲食建立小鼠NAFLD模型。高脂肪飲食(Research Diet D12492）和對(duì)照飲食（對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)飼料TP26338，南通特洛菲飼料科技有限公司）喂養(yǎng)小鼠24周后處死，取肝臟行病理檢測(cè)判斷脂肪肝模型建立是否成功。小鼠進(jìn)入動(dòng)物房后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后隨機(jī)進(jìn)行分組：對(duì)照飼料組（NC組）、對(duì)照飼料加雙歧桿菌干預(yù)組（NB組）、高脂飼料組（HF組）、高脂飼料加雙歧桿菌干預(yù)組(FB組)，每組分2籠，每籠飼養(yǎng)4只。每只小鼠每天進(jìn)行雙歧桿菌菌液（含雙歧桿菌 1×109CFU /mL）灌胃 200 μL/d，菌液現(xiàn)用現(xiàn)配，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 標(biāo)本采集每周記錄1次小鼠體質(zhì)量及進(jìn)食量，干預(yù)周期為24周。采集標(biāo)本前 1 d晚上開(kāi)始禁食，自由進(jìn)水。小鼠稱(chēng)重后，以5%（0.1 mL/10 g）水合氯醛腹腔注射麻醉。用摘眼球法采血至EP管中，隨后用脫頸椎法處死小鼠。立即取出肝臟稱(chēng)重，計(jì)算肝臟指數(shù)（肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量）并放入凍存管并置入液氮罐內(nèi)，同時(shí)取結(jié)腸、糞便凍存。EP管中的血液靜置2 h后分離血清（4 000 r/min離心15 min）用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 血清學(xué)檢測(cè)使用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測(cè)小鼠谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、血清葡萄糖、血清總膽固醇和血清三酰甘油。

1.4 病理學(xué)檢測(cè)小鼠處死后肝臟、回腸和結(jié)腸組織用 10% 甲醛固定。常規(guī)脫水、包埋、切片后制成石蠟切片，并用蘇木精-伊紅（H-E）染色。肝臟組織用油紅 O 和 Masson 三色（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)）染色評(píng)估脂肪變性程度?；啬c及結(jié)腸組織進(jìn)一步行閉鎖小帶蛋白1(zonula occludens 1，ZO-1)、緊密連接蛋白（occludin）免疫組化檢測(cè)。切片的每個(gè)位點(diǎn)觀察5個(gè)高倍鏡視野（×400），分別計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率（0～5%：0分；6～25%：1分；26～50%：2分；50%：3分），染色強(qiáng)度（0～3分），陽(yáng)性率×著色強(qiáng)度＝免疫組化積分。并予以油紅O染色液染色觀察脂肪變性情況。按照Masson三色法步驟來(lái)染色，觀察組織中纖維化情況。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定腸道組織中occludin、ZO-1、TNF-α、白細(xì)胞介素6（IL-6）的基因表達(dá)水平。從小鼠回腸和結(jié)腸組織提取總RNA（Takara Bio公司，日本），測(cè)定濃度后使用 SYBR Premix Ex Taq(Takara公司，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用ABI PRISM 7,500實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，采用兩步法PCR反應(yīng)。反應(yīng)混合物為在 95 ℃下孵育 300 s，然后進(jìn)行 35 倍放大，95 ℃ 下 30 s、60 ℃ 下 30 s和72 ℃ 下 30 s的循環(huán)。設(shè)定同樣的熒光閾值，采用相對(duì)定量方法用來(lái)確定經(jīng)過(guò)不同處理的樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間的表達(dá)差異，結(jié)果用 2?ΔΔCt方法計(jì)算。

1.6 Illumina Miseq 測(cè)序采用Miseq對(duì)腸道菌群進(jìn)行分析，尋找優(yōu)勢(shì)菌種，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高脂組及對(duì)照組糞便腸道菌群數(shù)量及優(yōu)勢(shì)菌群的差異。步驟如下，（1）基因組DNA抽提：完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA。（2）PCR擴(kuò)增：PCR采用TransGen AP221-02，TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR儀采用ABI GeneAmp?9700型；全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。（3）熒光定量：參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。（4）Miseq文庫(kù)構(gòu)建：連接“Y”字形接頭；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。（5）Miseq測(cè)序：DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”；PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴(kuò)增子線(xiàn)性化成為單鏈。加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成1個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第1輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類(lèi)；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3＇端黏性，繼續(xù)聚合第2個(gè)核苷酸；統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段的序列。（6）生物信息分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，近似正態(tài)分布的定量資料采用x±s表示。應(yīng)用析因設(shè)計(jì)方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)高脂因素及雙歧桿菌因素的作用，多組間樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，組間兩兩比較，如符合方差齊性，采用Bonferroni方法進(jìn)行檢驗(yàn)，如方差不齊，采用Tamhane方法進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 雙歧桿菌對(duì)小鼠進(jìn)食量及體質(zhì)量的影響經(jīng)24周西方高脂飼料飲食造模，結(jié)果（圖1）顯示：高脂飼料組小鼠攝入量明顯比對(duì)照飼料組多，但高脂飼料模型組間，雙歧桿菌灌胃組攝入量及能量不變，小鼠體質(zhì)量顯著減輕。從體質(zhì)量上可看出雙歧桿菌對(duì)西方高脂飲食引起的NAFLD有減輕體質(zhì)量作用（圖1）。結(jié)果（圖1、圖2）顯示，模型組小鼠肝臟質(zhì)量明顯增加（P＜0.001），經(jīng)雙歧桿菌灌胃處理后可顯著減輕高脂組肝臟質(zhì)量。

圖1 生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖及肝臟質(zhì)量圖

圖2 肝臟大體圖

2.2 小鼠空腹血糖及血脂情況結(jié)果（圖3）顯示：高脂組小鼠血糖及血清總膽固醇升高，經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后，血糖及血清總膽固醇有下降趨勢(shì)，血清三酰甘油各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 血糖及血脂圖

2.3 檢測(cè)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果（圖4）顯示：高脂飲食NAFLD造模組小鼠ALT、AST、GGT、ALP顯著升高（P＜0.001），經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后，AST顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），ALT、GGT、ALP雙歧桿菌干預(yù)組比高脂飼料組下降趨勢(shì)，提示雙歧桿菌可改善NAFLD的肝功能損傷。

圖4 雙歧桿菌干預(yù)后轉(zhuǎn)氨酶變化

2.4 肝臟H-E染色、油紅O染色和Masson染色結(jié)果（圖5）顯示：對(duì)照飼料組、對(duì)照飼料加雙歧桿菌干預(yù)組肝細(xì)胞未見(jiàn)變性，匯管區(qū)未見(jiàn)炎癥。而高脂飼料組肝臟肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞變性程度為重度，匯管區(qū)未見(jiàn)炎癥，而高脂飼料加雙歧桿菌干預(yù)組肝細(xì)胞也存在脂肪變性，但變性程度為輕至中度，匯管區(qū)未見(jiàn)炎癥。高脂組油紅O染色見(jiàn)高脂組內(nèi)大量脂滴形成，伴空泡變性，經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后，肝臟內(nèi)脂滴顯著減少。Masson染色結(jié)果顯示，高脂飼料NAFLD疾病模型組出現(xiàn)纖維化條索，而經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后高脂組無(wú)纖維化。

圖5 肝臟病理及油紅O染色、Masson染色

2.5 腸道功能檢測(cè)回結(jié)腸病理NC組、NB組黏膜層，黏膜下層和肌層均無(wú)明顯炎癥，而FB組黏膜層及黏膜下層均有輕至中度炎癥，肌層未見(jiàn)炎癥，HF組黏膜層中度炎癥（圖6）。ZO-1和occludin的PCR檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示：結(jié)腸和回腸組織內(nèi)HF組occludin及ZO-1減少，提示NAFLD組結(jié)腸和回腸組織均存在腸道黏膜屏障的損害，而FB組中，ZO-1和occludin均有不同程度的升高，提示雙歧桿菌可通過(guò)改善腸黏膜屏障來(lái)發(fā)揮對(duì)NAFLD的保護(hù)作用。檢測(cè)結(jié)腸及回腸組織中TNF-α和IL-6表達(dá)，結(jié)果顯示高脂飼料組腸道炎癥因子顯著升高，而高脂飼料加雙歧桿菌干預(yù)組升高不顯著。

圖6 回腸、結(jié)腸病理圖

圖7 腸道屏障及炎癥指標(biāo)

2.6 高通量檢測(cè)各組間腸道菌群差異結(jié)果（圖8A）顯示：此次檢測(cè)深度足夠。高脂組腸道菌群多樣性下降，經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后，可恢復(fù)腸道菌群多樣性（圖8B）。圖8C和圖8D顯示各組間腸道菌群存在顯著差異，高脂飼料組與對(duì)照飼料組比較，存在腸道菌群失衡，高脂飼料組經(jīng)雙歧桿菌干預(yù)后可改變腸道菌群。結(jié)果（圖8E）顯示從門(mén)水平，高脂組優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌門(mén)，而對(duì)照飼料組和對(duì)照飼料加雙歧桿菌干預(yù)組優(yōu)勢(shì)菌屬為厚壁菌門(mén)。結(jié)果（圖8F）顯示：高脂飼料組顯著升高了如下菌屬：Bacteroides、Helicobacter和Alloprevotella。高脂飼料加雙歧桿菌干預(yù)組增加了以下菌屬：Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Odoribacter、Anaerotruncus、Roseburia，而減少了以下屬的水平：Bacteroides。而LEfse分析結(jié)果顯示這些差異具有顯著性（圖8）。

圖8 16S腸道菌群分析

2.7 析因方差分析結(jié)果（表1）顯示，高脂因素對(duì)ALT、AST、GGT、血糖、肝臟質(zhì)量、結(jié)腸ZO-1、結(jié)腸IL-6都有顯著性作用，而雙歧桿菌干預(yù)可減少高脂飲食的作用。

表1 高脂因素及雙歧桿菌干預(yù)因素的析因方差分析結(jié)果

3 討 論

隨著生活條件的改善及飲食結(jié)構(gòu)的豐富，NAFLD已經(jīng)成為慢性肝病的第一大病因，影響了越來(lái)越多的患者。腸道微生物因其驚人的數(shù)量和高度的多樣化被稱(chēng)為人類(lèi)的“第2基因組”，對(duì)腸道局部免疫屏障功能的維持至關(guān)重要，有研究者［15］嘗試應(yīng)用各種益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群，恢復(fù)正常的腸道微生態(tài)，已獲得對(duì)肝脂肪變性的治療作用。Wong等［16］提出腸道微生物與肝臟疾病不同的機(jī)制或假說(shuō)，包括微生物群對(duì)能源利用的影響以及與肥胖的關(guān)系；微生物群對(duì)導(dǎo)致機(jī)體低度炎癥的腸道通透性的影響；腸道微生物群調(diào)節(jié)膳食膽堿代謝；腸道微生物群調(diào)節(jié)膽汁酸代謝；腸道微生物群內(nèi)源性產(chǎn)生肝臟毒性物質(zhì)（如乙醇）和其他揮發(fā)性有機(jī)化合物等［17］。

此外，腸道微生物還可以通過(guò)多種途徑對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生影響［18］。有研究［19］證實(shí)，無(wú)菌動(dòng)物的免疫功能較正常下降，具體表現(xiàn)為免疫器官形態(tài)的縮小以及免疫細(xì)胞數(shù)量的減少。令人驚喜的是，當(dāng)無(wú)菌動(dòng)物腸道的微生物得到恢復(fù)以后，其腸道及整個(gè)機(jī)體的免疫功能都得到相應(yīng)的增強(qiáng)［20］。雙歧桿菌在促進(jìn)維生素的合成與吸收、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用［21］。以往研究［22］發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌可能通過(guò)誘導(dǎo)DCs活化，從而糾正Th1/Th2細(xì)胞的失衡，另一方面，可以通過(guò)刺激DCs分泌TGF-β或IL-10調(diào)節(jié)CD4＋CD25＋Treg數(shù)量，進(jìn)而影響Treg/Th17細(xì)胞的分化。

腸道屏障功能損害包括腸道菌群紊亂、腸細(xì)胞緊密連接蛋白的改變、腸道通透性增高、血液中脂多糖（lipopoly-saccharide, LPS）升高等［23］。NAFLD患者腸道黏膜通透性增高，緊密連接完整性損傷，腸道革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分LPS進(jìn)入門(mén)脈系統(tǒng)，超過(guò)肝臟的清除能力后，可形成內(nèi)毒素血癥［24］。本研究表明，NAFLD模型小鼠末端回腸上皮細(xì)胞ZO-1、occludin RNA顯著減少，提示腸黏膜上皮細(xì)胞屏障功能減退。而高脂飼料組應(yīng)用雙歧桿菌干預(yù)后可改善腸道屏障功能。

此外，炎癥也在NAFLD的致病中發(fā)揮了重要作用，其中，腸道微生物紊亂是驅(qū)動(dòng)炎癥的主要因素［25］。本研究觀察到雙歧桿菌除了能改善肥胖小鼠的腸道屏障功能，同時(shí)能降低血清和腸道組織中TNF-α、IL-6等促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平。

綜上所述，與對(duì)照飼料組小鼠相比，高脂飼料組小鼠腸道菌群物種豐度和多樣性減少，存在腸道菌群失調(diào)，主成分分析（PcoA）及非度量尺度分析（NMDS）均能觀察各組標(biāo)本微生物菌群構(gòu)成的比較，結(jié)果顯示疾病模型組與陰性對(duì)照組腸道菌群構(gòu)成分隔較遠(yuǎn)，構(gòu)成上存在顯著差異。菌屬差異分析表現(xiàn)為高脂組擬桿菌門(mén)增多，厚壁菌門(mén)減少，擬桿菌屬增多。由此推測(cè)，雙歧桿菌可通過(guò)改善腸道菌群紊亂，發(fā)揮延緩NAFLD進(jìn)展的作用。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。