維生素D對(duì)Graves病Th17/Treg細(xì)胞失衡的調(diào)節(jié)作用

史良鳳，蘇怡倩，王傳杰

1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 201508

2.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海 201508

維生素D是一種甾體類化合物，在人體正常生理過程中起重要作用，可以調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽代謝，維持骨骼健康［1］。維生素D又被稱為免疫調(diào)節(jié)激素，在不同的非骨骼途徑中發(fā)揮特殊作用，而血清25-羥維生素D水平低與多種免疫相關(guān)疾病的發(fā)生相關(guān)［2-3］。

Graves?。℅raves’ disease，GD）是一種自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，細(xì)胞免疫和體液免疫均參與其中［4］。既往研究［5］證實(shí)，CD4＋Th2細(xì)胞能誘導(dǎo)促甲狀腺激素（TSH）受體結(jié)合抗體的產(chǎn)生，是導(dǎo)致GD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要免疫因素。而Th17和Treg細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的CD4＋Th細(xì)胞新亞型，Th17/Treg細(xì)胞比例失衡可導(dǎo)致免疫紊亂及免疫疾病的發(fā)生［6］。有研究［7］發(fā)現(xiàn)維生素D可抑制Th17細(xì)胞增殖，而甲狀腺細(xì)胞核內(nèi)存在維生素D受體，且GD患者存在較嚴(yán)重的維生素D缺乏［8］。因此，本研究探討初發(fā)GD患者進(jìn)行外周血1,25-二羥維生素D干預(yù)后，Th17、Treg細(xì)胞占比及兩者比值的變化，為臨床GD的進(jìn)一步診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2020年1月至2020年12月復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院收治的新發(fā)GD患者30例，選擇同期于我院進(jìn)行健康體檢且年齡、性別相匹配的健康者30例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）有甲狀腺毒癥臨床表現(xiàn)；（2）血清游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺激素（FT4）升高，TSH下降；（3）甲狀腺彌漫性腫大；（4）促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡小于18歲或大于70歲；（2）伴有系統(tǒng)性結(jié)締組織或其他自身免疫性疾病（如1型糖尿病、白癜風(fēng)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎等）；（3）有肺部疾病、肝腎功能不全、冠心病等慢性疾??；（4）就診前3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用抗甲狀腺藥物、含維生素D的藥物或保健品以及其他特殊藥物（如胺碘酮、免疫抑制或調(diào)節(jié)藥物）。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（JIEC2021-S33），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 臨床觀察指標(biāo)采集所有的研究對(duì)象清晨空腹外周血，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定FT4、FT3、TSH、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、TRAb和25-羥維生素D。

1.3外周血單核細(xì)胞（PBMC）維生素D干預(yù)留取GD患者和對(duì)照組EDTA抗凝管的空腹外周血，制備PBMC。將每例GD患者PBMC分為2份：一份不予以維生素D干預(yù)（GD未干預(yù)組）；另一份PBMC中加入1,25-二羥維生素D3（羅氏公司；10～(-7) mol/L［9-10］，100 μL）干預(yù) 48 h（GD干預(yù)組）。對(duì)GD未干預(yù)組、干預(yù)后的GD干預(yù)組及對(duì)照組PBMC進(jìn)行CD4＋I(xiàn)L-17（Th17細(xì)胞）和CD4＋Foxp3（Treg細(xì)胞）染色，采用Beckman Gallios流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用Kaluza Analysis 2.1軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用Tukey方法；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，采用Fisher確切概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析結(jié)果（表1）顯示：GD組和對(duì)照組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GD組血清TSH明顯低于對(duì)照組（P＜0.001），F(xiàn)T3、FT4、TPOAb、TRAb高于對(duì)照組（P＜0.001），TgAb與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組均存在維生素D不足（25-羥維生素D＜30 ng/mL），其中GD組更低，與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.004）。

表1 GD組和對(duì)照組一般資料比較

2.2 外周血Th17細(xì)胞占比結(jié)果（表2、圖1）顯示：GD未干預(yù)組、GD干預(yù)組、對(duì)照組研究對(duì)象間外周血Th17細(xì)胞占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝32.708，P＜0.001）。GD未干預(yù)組與干預(yù)組外周血Th17細(xì)胞占比均高于對(duì)照組（P＜0.001）；GD干預(yù)組與未干預(yù)組外周血Th17細(xì)胞占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.515）。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4＋I(xiàn)L-17（Th17細(xì)胞）占比

2.3 外周血Treg細(xì)胞占比結(jié)果（表2、圖2）顯示：GD未干預(yù)組、GD干預(yù)組、對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞占比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝4.050，P＝0.021）。GD干預(yù)組外周血Treg細(xì)胞占比較GD未干預(yù)組高（P＝0.019），兩GD組與對(duì)照組外周血Treg細(xì)胞占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（GD未干預(yù)組：P＝0.125；GD干預(yù)組：P＝0.711）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4＋Foxp3（Treg細(xì)胞）占比

2.4 Th17/Treg細(xì)胞比值結(jié)果（表2）顯示：GD未干預(yù)組、GD干預(yù)組、對(duì)照組外周血Th17/Treg細(xì)胞比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝36.893，P＜0.001）。兩GD組外周血Th17/Treg細(xì)胞失衡比值均高于對(duì)照組（P＜0.001）；GD干預(yù)組外周血Th17/Treg細(xì)胞比值較GD未干預(yù)組降低（P＜0.001）。

表2 3組研究對(duì)象外周血Th17、Treg細(xì)胞水平以及Th17/Treg比值比較n＝30

3 討 論

維生素D是一種類固醇激素，在維持血清鈣、磷水平方面起重要作用［11］。維生素D缺乏目前已成為一個(gè)全球性公共健康衛(wèi)生問題，在健康人群中發(fā)生率很高［12］。本研究中健康人群也存在血清維生素D不足，而GD患者維生素D缺乏較健康者更明顯（P＝0.004），與既往相關(guān)研究［13-15］結(jié)論一致。

維生素D參與細(xì)胞生長、分化和機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)。研究［16］表明，甲狀腺濾泡細(xì)胞中存在維生素D受體，1,25-二羥維生素D與其結(jié)合后通過基因表達(dá)調(diào)控影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成。1,25-二羥維生素D在免疫系統(tǒng)中主要作用于抗原提呈細(xì)胞（APC）和T細(xì)胞，可直接作用于T細(xì)胞，抑制抗原特異性T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生［17］。目前多項(xiàng)研究［18-19］認(rèn)為，Th17/Treg細(xì)胞失衡是GD發(fā)生、發(fā)展的重要作用機(jī)制之一。已有研究［20］發(fā)現(xiàn)，血清維生素D能使Th2細(xì)胞活性增強(qiáng)，并使Th1細(xì)胞活性減弱。近期有關(guān)非甲狀腺自身免疫疾病的研究［7］發(fā)現(xiàn)，維生素D能通過抑制Th1/Th17細(xì)胞而增強(qiáng)Treg細(xì)胞的活性。而補(bǔ)充維生素D可以改善自身免疫性甲狀腺疾病患者的甲狀腺功能及相關(guān)抗體水平［21］。此外，國內(nèi)最新研究［22］發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎患者中，維生素D受體表達(dá)與Th17/Treg細(xì)胞失衡密切相關(guān)。

本研究通過流式細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GD未干預(yù)組外周血Th17細(xì)胞占比較健康人明顯升高（P＜0.001），雖然2組外周血Treg細(xì)胞占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Th17/Treg細(xì)胞比值差異明顯（P＜0.001）。而加入1,25-二羥維生素D后，外周血Treg細(xì)胞占比上調(diào)以及外周血Th17/Treg細(xì)胞比值明顯下調(diào)（P＜0.05），與上述研究結(jié)論相符。

GD患者由于甲狀腺激素水平升高，骨吸收加速、破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，常存在鈣、磷負(fù)平衡，但多數(shù)患者發(fā)病早期血鈣、磷水平正常［23］。本研究對(duì)象為新發(fā)GD患者，病程相對(duì)短，患者未接受血清鈣、磷水平常規(guī)檢測(cè)，因此，本研究未納入血清鈣、磷水平，這是本研究的局限性之一。本研究對(duì)照組PBMC未給予1,25-二羥維生素D干預(yù)，后續(xù)須進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步探討維生素D對(duì)Th17/Treg細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。此外，由于試驗(yàn)條件限制，本研究未分析臨床治療上補(bǔ)充維生素D后，患者體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞的變化。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)初發(fā)GD患者血清維生素D水平較健康人下降更明顯，外周血Th17細(xì)胞明顯增多，存在Th17/Treg細(xì)胞平衡破壞，而給予維生素D可改善初發(fā)GD患者外周血Treg細(xì)胞占比及調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞失衡。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。