臘花組培快繁體系研究

白艷榮，蔣亞蓮，王進(jìn)英

（1昆明學(xué)院，昆明 650213；2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，昆明 650214）

0 引言

臘花(Chamelaucium uncinatum)為桃金娘科(Mycinatum)植物，即淘金彩梅，又名杰拉爾頓臘花或風(fēng)臘花。臘花可作高檔鮮切花、綠化景觀樹(shù)、盆景、香精萃取等，具有較高的觀花、觀葉及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于蠟花雄蕊較長(zhǎng)伸出花外、雌蕊隱蔽于花心之內(nèi)導(dǎo)致不結(jié)實(shí)。目前，主要繁殖方式為扦插繁殖。扦插繁殖慢且生根率低，難以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求。有關(guān)風(fēng)臘花組培的研究，錢(qián)仲秀等[4]以3年生當(dāng)年長(zhǎng)出的半木質(zhì)化嫩枝作為外植體，初代培養(yǎng)并獲得了成功；婁麗華等[5]采用半木質(zhì)化嫩莖頂芽作為外植體，成功建立了無(wú)菌體系；湯桂軍等[6]以春季抽伸的半木質(zhì)化嫩莖莖段作為外植體，生根率可達(dá)80%；但尚未解決生根率低的問(wèn)題，不能滿(mǎn)足生產(chǎn)上的需要。筆者以臘花的嫩芽嫩莖為繁殖材料，研究和完善臘花的組培快繁技術(shù)體系，旨在為臘花種苗工廠(chǎng)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取臘花半木質(zhì)化嫩枝頂芽做外植體。

1.2 主要試劑

試劑包括蔗糖、瓊脂、HCl、NaOH、75%酒精、2%次氯酸，激素KT、6-BA、IBA、NAA，MS、1/2MS培養(yǎng)基母液。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 初代培養(yǎng) 以MS為基本培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖和0.62%的瓊脂，培養(yǎng)基pH 5.8～6.0。設(shè)置KT(0、2、3、4 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)濃度梯度組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。選取臘花半木質(zhì)化嫩枝頂芽做好消毒處理后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，設(shè)置9個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理接種3瓶，3次重復(fù)，每瓶接種2個(gè)外植體，每個(gè)處理接種18個(gè)芽（＞0.5 cm的芽），30天后分別統(tǒng)計(jì)不同激素濃度組合對(duì)臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，篩選最佳激素濃度配比的培養(yǎng)基。

1.3.2 增殖培養(yǎng) 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加3%的蔗糖和0.62%的瓊脂，培養(yǎng)基pH 5.8～6.0。設(shè)置6-BA(0、0.5、1.0、1.5 mg/L)、NAA(0、0.1、0.2、0.3 mg/L)濃度梯度組合的增殖培養(yǎng)基。選取生長(zhǎng)健壯的、長(zhǎng)勢(shì)一致的臘花無(wú)菌苗接種到增殖培養(yǎng)基上，設(shè)置9個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理接種3瓶，重復(fù)3次，每瓶處理接種3株，每個(gè)處理接種27個(gè)芽，培養(yǎng)45天后，分別統(tǒng)計(jì)組培苗的增殖情況，研究不同濃度激素梯度組合對(duì)試管苗增殖的影響，篩選最佳的增殖培養(yǎng)基。

1.3.3 生根培養(yǎng) 以1/2MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將無(wú)菌芽接種到不同濃度IBA(0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L)的生根培養(yǎng)基上，添加3%的蔗糖、0.62%的瓊脂和0.1%的活性炭，pH 5.8～6.0，設(shè)置6個(gè)處理、1個(gè)對(duì)照，每個(gè)處理轉(zhuǎn)接3瓶，每瓶接種3株，重復(fù)3次，每個(gè)處理接種27株無(wú)菌苗，培養(yǎng)60天后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，研究不同濃度的IBA對(duì)組培苗生根的影響，篩選最佳的培養(yǎng)基配方。

隨機(jī)每個(gè)處理取10株長(zhǎng)勢(shì)一致的臘花組培苗，將組培苗取出，用清水對(duì)根系進(jìn)行清洗，測(cè)量每株的根長(zhǎng)，平均值即為根長(zhǎng)。以組培苗根基0.5 cm處的直徑作為根粗。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制 每個(gè)處理配制500 mL的培養(yǎng)基，裝9瓶，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)量取母液。在制備MS培養(yǎng)基時(shí)，母液量取應(yīng)是大量元素和微量元素各5 mL/L；在制備1/2MS培養(yǎng)基時(shí)，母液量取應(yīng)是按大量元素2.5 mL/L、微量元素5 mL/L和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑加入燒杯中，加入15 g蔗糖，再加入瓊脂攪拌均勻后定容，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH 5.8～6.0，之后分裝到培養(yǎng)瓶中，每瓶裝55～60 mL的培養(yǎng)基，蓋上蓋子密封，添加到培養(yǎng)基中的激素或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都需提前滅菌，置于滅菌架上放到高壓蒸汽滅菌鍋中，在溫度為121℃下滅菌2 min，等溫度和壓力下降后取出培養(yǎng)基備用。

1.4.2 滅菌與接種 剪去相對(duì)幼嫩的半木質(zhì)化枝條頂芽作為外植體，長(zhǎng)度為1～2 cm，剪好后的材料用洗潔精浸泡2 min，用自來(lái)水清洗干凈后用自來(lái)水流動(dòng)沖洗2 h，之后到接種室用75%酒精清洗30 s后用無(wú)菌水清洗3次，每次清洗時(shí)間為25～30 s。用4%氯酸鈉溶液浸泡15 min后，用無(wú)菌水清洗5遍，每次30 s，清洗好的外植體放到無(wú)菌接種盤(pán)用無(wú)菌紙把水分吸干，把無(wú)菌外植體接種到臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

將接種后的臘花外植體在培養(yǎng)架中進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)的溫度為(23±2)℃，光強(qiáng)為1500～2000 lx，光照時(shí)間為12～14 h/d。在培養(yǎng)的過(guò)程中每隔7天觀察一次培養(yǎng)瓶中苗的生長(zhǎng)狀況，誘導(dǎo)培養(yǎng)30天后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，增殖培養(yǎng)45天后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，生根培養(yǎng)60天后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計(jì)分析，篩選出最適宜臘花生長(zhǎng)的誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較分析不同處理之間的差異，差異顯著性水平為P=0.05。所有的統(tǒng)計(jì)分析均在SPSS 24中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素(KT、NAA)濃度組合對(duì)臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

由表1可見(jiàn)，不同濃度的激素(KT、NAA)濃度組合對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響有差異。當(dāng)KT 3 mg/L、NAA 0.2 mg/L（A5處理）時(shí)，在此濃度組合下誘導(dǎo)效果是最理想的，發(fā)生個(gè)數(shù)達(dá)到16個(gè)，發(fā)生率達(dá)到88.83%，植株生長(zhǎng)健壯，葉色為深綠色；A5與A1、A4、A6對(duì)比，雖然A1、A4、A6植株生長(zhǎng)健壯，但是發(fā)生數(shù)和發(fā)生率不理想；A2、A3植株生長(zhǎng)較為緩慢，但是苗生長(zhǎng)健壯，有一定的利用價(jià)值；A7、A8雖然發(fā)生率不低，但是苗生長(zhǎng)緩慢，且植株矮小細(xì)弱；A9、A10、A11苗生長(zhǎng)緩慢且矮小細(xì)弱，出現(xiàn)玻璃化苗的情況，3個(gè)處理誘導(dǎo)出的苗基本無(wú)利用價(jià)值。

表1 風(fēng)蠟花誘導(dǎo)培養(yǎng)基（KT和NAA濃度配比）研究結(jié)果

激素KT、NAA在中等水平對(duì)臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最有利。處理A1～A3 KT濃度不斷上升，但是NAA濃度較低，臘花誘導(dǎo)效果都不理想；A4、A6、A7濃度梯度比較接近中等水平，誘導(dǎo)率處于中等水平；A8、A9處理，隨著激素濃度梯度不斷增大，發(fā)生率下降；A10、A11培養(yǎng)基中不添加KT、NAA，誘導(dǎo)率最低。激素濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于臘花的誘導(dǎo)培養(yǎng)，在激素KT濃度 2、3、4 mg/L，NAA 濃度 0.1、0.2、0.3 mg/L，KT:NAA為3:1時(shí)，臘花誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好。

2.2 不同激素(6-BA、NAA)濃度組合對(duì)臘花增殖培養(yǎng)效果的影響

由表2可得，不同激素(6-BA、NAA)濃度組合對(duì)臘花增殖效果有顯著不同。6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L（B2處理）時(shí)，增殖效果最為理想，增殖系數(shù)達(dá)到3.6倍，增殖倍數(shù)達(dá)到4.17倍，植株生長(zhǎng)健壯，芽較多，葉色深綠色；B3、B4處理雖然增殖系數(shù)和增殖倍數(shù)較高，但是植株生長(zhǎng)細(xì)弱、葉色淺綠，不是特別理想；B1、B7處理植株生長(zhǎng)健壯、葉色深綠，表現(xiàn)為中等水平，增殖系數(shù)和倍數(shù)較B2處理低，但增殖的苗可以利用，其中，B1有一部分苗生長(zhǎng)欠佳，但是B7的苗相對(duì)于B1來(lái)看生長(zhǎng)健壯、葉色深綠，則B7比B1增殖效果稍好；B5、B6、B10處理增殖系數(shù)、增殖倍數(shù)都較低，但是增殖苗生長(zhǎng)健壯，葉色深綠、營(yíng)養(yǎng)充足，增殖苗可利用；B3、B4處理雖然增殖系數(shù)以及增殖倍數(shù)都較高，但是增殖苗長(zhǎng)勢(shì)較弱，葉色不正，增殖苗營(yíng)養(yǎng)不良；增殖效果最差的是B8、B9、B11處理，增殖系數(shù)比較低，而且苗幾乎不生長(zhǎng)，45天增殖苗已經(jīng)開(kāi)始老化，B11增殖倍數(shù)在所有處理中最高，但是增殖苗植株微型化、玻璃花，培育的苗無(wú)利用價(jià)值。

表2 臘花叢生芽增殖培養(yǎng)基（6-BA和NAA不同濃度配比）研究結(jié)果

當(dāng)6-BA濃度過(guò)高、NAA濃度低有利于芽的分化，但不利于芽的生長(zhǎng)；當(dāng)6-BA濃度過(guò)低、NAA濃度過(guò)高不利于芽的分化，但能促進(jìn)芽的生長(zhǎng)。只有6-BA:NAA=10:1時(shí)，既能促進(jìn)芽的分化又有利于幼芽的生長(zhǎng)，獲得好的增殖苗。

2.3 不同濃度的IBA對(duì)臘花生根效果的影響

由表3可知，激素IBA濃度為0.6 mg/L（C3處理）時(shí)，臘花生根培養(yǎng)效果最佳，接種的無(wú)菌苗生根率100%，平均每株生根條數(shù)為6.84條，平均根長(zhǎng)為6.86 cm，植株生根時(shí)間最早，且生長(zhǎng)健壯、葉色深綠。C2、C4處理生根數(shù)中等，植株生長(zhǎng)健壯，但是C4比C2生根時(shí)間晚，且長(zhǎng)勢(shì)稍弱。較為一般的是C1處理，植株生長(zhǎng)健壯，葉色深綠，但是生根時(shí)間較晚，且單株生根數(shù)較少。處理CK生根時(shí)間較晚，且平均每株生根數(shù)較少，此處理不適合生根培養(yǎng)。激素IBA濃度為0.6 mg/L最適宜臘花的生根培養(yǎng)，IBA濃度過(guò)高或過(guò)低都達(dá)不到最佳的生根效果。從表中可以看出，不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑無(wú)菌苗也能生根，但是根系細(xì)小，植株矮小，營(yíng)養(yǎng)不良，不利于生根培養(yǎng)。

表3 不同濃度的IBA對(duì)臘花生根效果的研究結(jié)果

3 結(jié)論

（1）在臘花誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，最適宜臘花誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為MS+KT 3 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂6.2 g/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8，發(fā)生率達(dá)到88.8%，苗生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)良好，葉色深綠。

（2）在臘花增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，最適宜臘花增殖培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.2 g/L，pH 5.8，增殖系數(shù)達(dá)到3.6倍，增殖倍數(shù)達(dá)到4.2倍，植株生長(zhǎng)健壯，葉色深綠。

（3）在臘花生根培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，最適宜臘花生根培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA0.6 mg/L+瓊脂6.2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.1 g/L，pH 5.8，最早生根時(shí)間為15天，平均每株生根數(shù)為6.8條，平均根長(zhǎng)為6.9 cm,，生根率100%，植株生長(zhǎng)健壯，葉色深綠。

4 討論

臘花組織培養(yǎng)常用的外植體有莖尖、芽、莖段、葉片、花粉。一般幼嫩的組織材料褐變相對(duì)于較老化的組織材料來(lái)說(shuō)較輕；另外，減小組織切口面積以及縮短組織暴露在空氣中的時(shí)間有利于減輕褐化。在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和活性炭等都可以有效預(yù)防褐化的發(fā)生。有效的預(yù)防組織褐化方法有5種。（1）選擇適宜的外植體，一般以臘花的嫩莖、頂芽最為理想；（2）加入抗氧化劑或吸附劑，能有效減少褐化；（3）連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體，對(duì)于新接種的外植體，將其快速轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上2～3次，在某些情況下可以減輕褐化，這段時(shí)間外植體的切口愈合，外滲停止；（4）對(duì)外植體進(jìn)行消毒預(yù)處理；（5）給接種后的外植體適宜的暗處理。

錢(qián)仲秀等[4]以嫩莖為外植體，加入0.7%的PVP（聚乙烯聚吡氯烷酮）能有效防止褐變，平均發(fā)生率高達(dá)80%，最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+IBA 0.5 mg/L，平均每株生根數(shù)4～5條，生根率為77.8%。本實(shí)驗(yàn)加入了0.1 g/L的活性炭，增強(qiáng)了培養(yǎng)基的吸附能力，更有利于臘花植株的生長(zhǎng)。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，IBA濃度過(guò)高或過(guò)低對(duì)臘花生根培養(yǎng)都無(wú)優(yōu)勢(shì)，IBA0.6 mg/L最適宜臘花的生根培養(yǎng)。