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    聚乳酸羥基乙酸-甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白復(fù)合微球的制備 形態(tài)表征及生物相容性研究

    2022-07-08 01:21:36劉金晶周強強龍桂月廖紅兵
    中國臨床新醫(yī)學(xué) 2022年6期
    關(guān)鍵詞:明膠微球培養(yǎng)液

    劉金晶, 周強強, 龍桂月, 黃 臻, 廖紅兵

    隨著生物制藥和生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展,生物活性大分子治療發(fā)展迅速,而如何將生物活性大分子安全有效地運載至體內(nèi),并保持有效濃度,是其臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一。理想的生物活性大分子運載系統(tǒng)需具備以下性能:(1)良好的生物相容性;(2)生物可降解性;(3)非免疫原性[1]。聚乳酸羥基乙酸(polylactide-co-glycolide,PLGA)是一種常用的高分子可降解聚合物,在水環(huán)境內(nèi),聚合物的酯鍵水解,每個水解酯鍵形成一個羥基和一個羧基。酯鍵水解導(dǎo)致聚合物長鏈被切斷,增加PLGA的親水性,更易形成水溶性碎片。最終,這些水溶性碎片降解成為乳酸和乙醇酸,可進(jìn)一步在體內(nèi)被降解為二氧化碳和水,對機體無毒性[2]。由于PLGA具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性,已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)為有效的藥物傳遞載體[3-4]。蛋白質(zhì)可通過包埋和吸附的方式加載到空白PLGA微球內(nèi),制成藥物緩釋體系。除了微球給藥體系,另有藥物涂層等方式[5]。有研究者設(shè)計并成功制備出負(fù)載胰島素的PLGA納米顆粒,并且PLGA納米顆粒外覆由5β-膽酸修飾的乙二醇?xì)ぞ厶?,以此改善胰島素的口服給藥效果[6]。PLGA還能與一些骨替代材料,如羥基磷灰石、磷酸鈣類材料復(fù)合,以改善骨替代材料的性能[7-9]。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)對骨代謝有雙重作用,有研究表明在低濃度劑量作用下,PTHrP能促進(jìn)骨生成,而在高濃度作用下則會引起破骨效應(yīng)[10]。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)具有良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性、自凝性以及可注射性,但是其降解效率低,材料凝固后內(nèi)部缺少孔隙,這使得CPC的降解速率與新骨生成速率不匹配[11-12]。將PTHrP裝載到PLGA微球[即負(fù)載PTHrP的PLGA微球(polylactide-co-glycolide microspheres loaded with parathyroid hormone-related protein,PLGA-PTHrP)],將其引入CPC內(nèi)部,得到CPC/PLGA-PTHrP復(fù)合材料體系。PLGA降解,PTHrP持續(xù)釋放以促進(jìn)CPC的早期降解,在CPC內(nèi)部形成分散的孔隙,促進(jìn)早期成骨[13]。本研究制備PLGA-PTHrP,并觀察其在體外的表征、蛋白質(zhì)釋放特點,以及其對大鼠全骨髓細(xì)胞的增殖效應(yīng)影響?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1材料與儀器 聚乙烯醇(poly vinyl alcohol,PVA;四川維尼綸廠),二氯甲烷(天津大學(xué)科威公司),PLGA(分子量1.3萬,羧基末端,50∶50;山東省藥學(xué)科學(xué)院),PTHrP(美國Protech),集熱式磁力攪拌器(德國IKA),掃描電子顯微鏡(德國Zeiss),冷凍干燥機(上海億倍實業(yè)),AMEM培養(yǎng)液(美國HyClone),胎牛血清(澳洲GIBCO),青鏈霉素混合液(北京索萊寶有限公司)。SD大鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

    1.2實驗方法

    1.2.1 復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備空白PLGA微球 2 g PVA中加入100 ml去離子水,放置于集熱式磁力攪拌器上,緩慢加熱至90 ℃,持續(xù)攪拌至PVA完全溶解,制備成2% PVA外相水。取60 mg PLGA于15 ml離心管,轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥內(nèi),加入3 ml二氯甲烷,高速震蕩至PLGA完全溶解,制備成20%初乳。向初乳內(nèi)加入0.9 ml去離子水,高速震蕩10 s,將所得溶液快速轉(zhuǎn)移至5 ml注射器內(nèi),快速均勻滴加至30 ml 2% PVA外相水中,冰浴下磁力攪拌機8 000 r/min,15 s,制備成復(fù)乳。將復(fù)乳溶液轉(zhuǎn)移至含270 ml去離子水的燒杯內(nèi),置于磁力攪拌機上,500 r/min攪拌4 h,使二氯甲烷揮發(fā)。溶劑揮發(fā)后,停止攪拌,靜置0.5 h,得到白色沉淀物,即為PLGA空白微球。收集白色沉淀于離心管,雙蒸水洗滌,室溫下4 000 r/min,離心5 min,反復(fù)吹打洗滌3次。將收集到的空白PLGA微球在真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥24 h,-20 ℃保存。

    1.2.2 PLGA-PTHrP制備 無菌條件下,配制不同濃度的PTHrP溶液,分為:A組,1.5 μg/ml;B組,1.0 μg/ml;C組,0.5 μg/ml。各組蛋白質(zhì)溶液均為5 ml。稱取0.2 g空白PLGA微球,將微球與各組蛋白質(zhì)溶液混合,震蕩混勻,靜置30 min,收集微球,冷凍干燥,-20 ℃低溫保存。

    1.2.3 微球形態(tài)觀察及粒徑測量 取空白PLGA微球制樣,掃描電鏡下觀察微球形態(tài)結(jié)構(gòu),使用激光粒度分析儀測量微球的粒徑范圍,計算平均粒徑。掃描電鏡圖用Image-Pro Plus軟件分析。

    1.2.4 PLGA-PTHrP的體外釋放檢測 根據(jù)試劑盒說明書配制BCA工作液,取10 μl的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液(5 mg/ml),生理鹽水稀釋10倍作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。分別取標(biāo)準(zhǔn)品0、1、2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板內(nèi),再分別加入20、19、18、16、12、8、4、0 μl生理鹽水,混勻,每孔終體積為20 μl。向各孔內(nèi)分別加入200 μl BCA溶液,靜置1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測595 nm波長下各孔OD值,繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。后將200 μg載不同濃度PTHrP的PLGA微球分別浸泡在含1 ml磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)的離心管內(nèi),37 ℃恒溫?fù)u床振蕩,并于1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d和12 d,分別取20 μl浸提液,應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行檢測,根據(jù)所得OD值和蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PTHrP濃度,并繪制蛋白累計釋放曲線。

    1.2.5 PLGA-PTHrP對全骨髓細(xì)胞增殖影響的觀察

    取4~8周齡SD大鼠,以過量麻醉法處死,無菌條件下分離取出股骨、脛骨,去凈軟組織,儲存于PBS溶液(含1%青鏈霉素雙抗)中。移至超凈工作臺,剪去兩端骨骺端,用注射器吸取AMEM培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素雙抗)從兩端沖出骨髓直至髓腔發(fā)白。收集培養(yǎng)液于離心管,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,細(xì)胞重懸接種于T25培養(yǎng)瓶,使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),1%雙抗的AMEM培養(yǎng)液作為完全培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h,培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。收集上清液,1 000 r/min離心5 min,棄上清后重懸,重新接種于T25培養(yǎng)瓶中。每2 d換液1次,繼續(xù)培養(yǎng)3 d。收集細(xì)胞,以4×104cells/ml細(xì)胞濃度接種至96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μl。實驗分組:空白對照組(完全培養(yǎng)液)、PLGA微球組(含1 mg/ml空白PLGA微球的完全培養(yǎng)液)、PLGA-PTHrP組(含1 mg/ml PLGA-PTHrP微球的完全培養(yǎng)液)。培養(yǎng)12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d后,每孔加入10 μl,5%的CCK-8溶液,避光培養(yǎng)2.5 h,酶標(biāo)儀檢測記錄450 nm波長下各孔OD值。

    2 結(jié)果

    2.1PLGA微球形態(tài)觀察和粒徑檢測結(jié)果 在200倍鏡下,PLGA微球呈球形或類球形,分散均勻。500倍鏡下,可見微球表面較規(guī)則平整,有些微球呈現(xiàn)為多孔狀。隨機選擇300個微球,經(jīng)激光粒度分析儀測算,微球的平均粒徑為(56.73±7.22)μm。見圖1~2。

    ?200×;?500×;?1 000×;?1 000×

    圖2 PLGA微球粒徑分布圖

    2.2PLGA-PTHrP體外釋放檢測結(jié)果 在前100 h,各組載蛋白微球的蛋白釋放速率較高,蛋白釋放量達(dá)到蛋白總量的63.1%。隨后進(jìn)入釋放平緩期,總緩釋時間達(dá)到300 h。至緩釋結(jié)束,蛋白釋放量達(dá)總量的87.3%。見圖3。

    圖3 PLGA-PTHrP的PTHrP累計釋放量變化圖

    2.3PLGA-PTHrP對全骨髓細(xì)胞增殖活性的影響

    CCK-8檢測結(jié)果顯示,在細(xì)胞接種后第1天,三組細(xì)胞均無明顯的增殖現(xiàn)象,隨后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期,增殖速度明顯升高。到第7~9天時,細(xì)胞增殖速度減緩。三組細(xì)胞的增殖情況無顯著差異。見圖4。

    圖4 三組不同時間點OD值變化圖

    3 討論

    3.1微球研發(fā)的歷史可追溯至20世紀(jì)末期,按構(gòu)成微球的成分可將其分為有機聚合物微球和無機微球。本研究所制微球?qū)儆谟袡C聚合物微球。構(gòu)成有機聚合物微球的有機聚合物主要包含蛋白類高分子聚合物,如明膠、白蛋白、多糖類高分子聚合物以及合成類高分子聚合物等[14]。明膠是一種天然高分子蛋白,具有良好的生物相容性和降解性。在醫(yī)學(xué)方面,明膠微球常用于藥物緩釋、栓塞治療、體內(nèi)示蹤和組織工程等方面;在藥物緩釋方面,明膠微球的體外藥物釋放率與明膠微球的溶脹率有關(guān)。有學(xué)者制備了與更昔洛韋交聯(lián)的明膠微球,其體外藥物釋放與明膠和藥物的比例有關(guān),明膠和藥物的比值越高,釋放越慢,藥物突釋效應(yīng)越小[15]。殼聚糖中含有大量的氨基和羥基,是天然堿性多糖,有良好的生物相容性、可降解性,故殼聚糖在組織工程、藥物遞送、藥物緩釋等方面廣泛應(yīng)用。殼聚糖常與明膠制備成明膠-殼聚糖復(fù)合微球,常作為組織工程的支架。有研究分別制備了包裹雙氯酚酸鈉的明膠微球、殼聚糖微球和明膠-殼聚糖復(fù)合微球,體外釋放實驗結(jié)果顯示復(fù)合微球的前期藥物突釋情況、釋藥時間以及藥物釋放量優(yōu)于單一微球[16]。PLGA等合成高分子聚合物成球性好,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,能穩(wěn)定地釋放裝載在微球里的藥物等活性物質(zhì),釋放速率對藥物性質(zhì)的依賴性較小[17]。PLGA微球制備方法包括復(fù)乳溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、相分離法、微流體法、膜乳化技術(shù)等。噴霧干燥法制得微球的藥物包封率較高,生物活性好,而微粒容易黏附在噴霧干燥器的內(nèi)壁,對于熱敏性高的藥物,則不適用該方法。相分離法制備過程復(fù)雜,對攪拌方式、攪拌速度、有機溶液種類、有機溶液濃度、萃取液等因素都有嚴(yán)格的要求,同時對載藥微球的粒徑、形態(tài)、藥物包封率等有顯著影響[18-19]。膜乳化技術(shù)制備的微球尺寸均一,條件可控,能制備小粒徑的載藥微球,但是微球生成的速率較緩慢[20]。復(fù)乳溶劑揮發(fā)法是制備載蛋白以及肽類藥物微球的金標(biāo)準(zhǔn)。該法簡單易行,能在一定程度上控制微球粒徑,但是在封裝蛋白質(zhì)等大分子時,蛋白質(zhì)分子在水-有機物介質(zhì)表面容易發(fā)生結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,有可能會造成結(jié)構(gòu)展開或者聚集。目前主要通過添加血清白蛋白、糖類等賦形劑來維持蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[21]。

    3.2在以上幾種微球類型以及制備方法中,經(jīng)綜合考慮設(shè)備要求、制備工藝、操作可行性以及裝載藥物類型,本課題組選擇復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備微球。結(jié)果顯示,所得PLGA微球的尺寸均勻,形態(tài)規(guī)則,且最終制得的PLGA-PTHrP微球在體外實驗中顯示出較好的緩釋效應(yīng)。CCK-8實驗表明,與空白對照組相比較,空白微球和載蛋白微球共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖效應(yīng)并未受到抑制,提示PLGA微球和載蛋白濃度為1.5 μg/ml的微球?qū)Υ笫笕撬杓?xì)胞沒有毒性,生物相容性好,可用于后續(xù)實驗研究。PTHrP可以通過上調(diào)核因子-κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)表達(dá),促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,促進(jìn)骨吸收。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),PLGA作為致孔劑制備的CPC/PLGA復(fù)合材料在植入體內(nèi)4周可觀察到破骨樣細(xì)胞首先對PLGA微球進(jìn)行吞噬消化,在CPC基質(zhì)內(nèi)部形成孔隙,后期形成的新骨與微球降解前的形態(tài)一致,呈骨球狀[7]。本課題組將PTHrP負(fù)載于PLGA微球內(nèi)制備得到PLGA-PTHrP,其創(chuàng)新點在于PLGA既作為蛋白載體也作為一種致孔劑,后續(xù)工作把該復(fù)合微球引入骨替代材料(如CPC內(nèi)部),期望通過PLGA的早期降解以及PTHrP的局部釋放促進(jìn)破骨活動,以加速CPC的早期降解,彌補其降解速度與新骨生成速度不匹配的缺點。

    3.3但是,本實驗也有一些不足之處:PTHrP在初期有蛋白突發(fā)釋放的現(xiàn)象,各組載蛋白PLGA微球在前100 h內(nèi)蛋白的釋放速率較快,釋放量達(dá)到蛋白總量的63.1%。關(guān)于如何解決藥物突發(fā)釋放問題,仍是目前載藥系統(tǒng)研發(fā)的難點之一。藥物的釋放一般可以分為初始突發(fā)釋放、滯后時間、侵蝕加速釋放三個階段[22]。藥物的突發(fā)釋放與PLGA微球表面的弱結(jié)合以及吸附分子有關(guān),該階段不利于藥物的持續(xù)釋放。為了解決藥物的突發(fā)釋放問題,目前的研究主要集中在改進(jìn)制備微球的配方以及對負(fù)載藥物的修飾上。在制備過程中可以縮短溶劑蒸發(fā)時間或選擇無毒的有機溶劑。此外,還有研究者制備載艾塞那肽的卵磷脂納米粒,再將納米顆粒封裝進(jìn)PLGA微球內(nèi),結(jié)果顯示,封裝納米顆粒的PLGA微球初始突發(fā)釋放明顯減少[23-24]。

    綜上所述,本研究成功制備了負(fù)載有效濃度PTHrP的PLGA微球,但只探索了其在體外的緩釋效應(yīng)以及其對細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響,還需進(jìn)一步驗證該載藥系統(tǒng)的生物相容性,并進(jìn)行動物實驗以驗證其在體內(nèi)的緩釋效應(yīng)。

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