長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡、遷移及侵襲能力調(diào)控作用

常旭東， 李宏宇， 陳 江， 馮 吉， 李謙謙， 王煜曄， 高 聰， 劉小毓， 高 飛

1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽(yáng) 1100162.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116000

胰腺癌是惡性程度極高的消化道系統(tǒng)腫瘤之一，病死率較高［1］。在全球工業(yè)化國(guó)家中，胰腺癌是癌癥死亡的第七大原因［2］。據(jù)GLOBOCAN 2020估計(jì)，僅2020年，全球新增胰腺癌患者495 773例，新增胰腺癌死亡患者466 003例［3］。雖然，目前已經(jīng)確定了胰腺癌的一些發(fā)病危險(xiǎn)因素，如吸煙、肥胖、糖尿病、遺傳等，但具體發(fā)病原因仍不清楚［4］。其早期無(wú)明顯癥狀及體征，不易被察覺(jué)，絕大多數(shù)患者就診時(shí)通常已經(jīng)是晚期［4-5］。胰腺癌的治療往往是手術(shù)聯(lián)合放療、化療等方式，雖可短暫延長(zhǎng)患者的生存期，但總體來(lái)看，有效率低，預(yù)后較差［6］。5年存活率低至5%～13%［7］。因此，積極探索胰腺癌細(xì)胞表型的調(diào)控基因是開(kāi)發(fā)新的有效治療方法的關(guān)鍵。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的RNA分子［8］。其中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA GAS5（lncRNA GAS5）被報(bào)道為多種癌癥的腫瘤抑制因子［8-9］，但是其對(duì)胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1的表型調(diào)控情況尚不明確。本研究旨在通過(guò)探討GAS5對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的凋亡、遷移及侵襲的調(diào)控，為胰腺癌提供潛在的治療靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司）中添加10%胎牛血清（購(gòu)自天津康源生物技術(shù)有限公司），并在80%～90%的融合條件下傳代。所有細(xì)胞在5% CO2加濕的環(huán)境中維持在37℃。攜帶GAS5的pcDNA載體（pcDNA-GAS5）由上?；蚧び邢薰荆ㄖ袊?guó)）構(gòu)建，用于構(gòu)建GAS5過(guò)表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞系。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 分別將lipo2000 pcDNA3質(zhì)粒（1 μg／μl）和pcDNA3-GAS5質(zhì)粒（1 μg／μl）轉(zhuǎn)染至AsPC-1細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒的AsPC-1細(xì)胞組設(shè)為對(duì)照組，將轉(zhuǎn)染pcDNA3-GAS5質(zhì)粒的AsPC-1細(xì)胞組設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，將培養(yǎng)瓶置于37℃、 5%CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后，使用15% FCS 1640的新鮮培養(yǎng)基換液。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)42 h，收集兩組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書(shū)，使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）從細(xì)胞中提取總RNA。將總RNA應(yīng)用于cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（applied Biosystems）中 檢 測(cè)GAS5 mRNA。使 用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）檢測(cè)GAS5 mRNA的相對(duì)表達(dá)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃變 性15 s，60℃退 火 和 延 伸1 min，40 個(gè) 循 環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。特異性引物GAS5序列為正向5′- 3′：GTATGGTGCTGGGTGCG；反向5′- 3′：TAGGCTTGCTCTTTAGGACTT；β-actin序列為正向5′- 3′：GAAGGTGACAGCAGTCGGTT；反向5′- 3′：AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT，由凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司提供。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞，進(jìn)行AnnexinV／PI染色，具體操作步驟按照PE AnnexinV Apoptosis Detection Kit I說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并通過(guò)FACScanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞，將細(xì)胞分別以16 000個(gè)／cm2接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合率＞90%時(shí)，進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞劃痕后0 h、24 h、48 h，采用Nikon Eclipse Ti-s顯微鏡（日本Nikon公司）觀察并獲取圖像，劃痕區(qū)域面積通過(guò)Image J軟件進(jìn)行測(cè)量。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell上室中加入150 μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司），37℃條件下凝固5 h進(jìn)行基質(zhì)膠包被。轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞，分別調(diào)整對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì) 胞密度 為2×105個(gè)／ml，各 取500 μl接種至Transwell上室中。下室加入1 ml含20% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后PBS洗滌Transwell上室，用無(wú)水冰甲醇固定30 min，PBS洗滌后，用0.4%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦掉上室中未穿過(guò)的細(xì)胞，采用Nikon Eclipse Ti-s顯微鏡觀察并獲取圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AsPC-1胰腺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染GAS5基因表達(dá)檢測(cè) AsPC-1細(xì)胞系轉(zhuǎn)染GFP熒光質(zhì)粒（圖1a），明場(chǎng)條件下和熒光條件下均可見(jiàn)目標(biāo)GFP蛋白陽(yáng)性的表達(dá)，顯示轉(zhuǎn)染目標(biāo)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率良好。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，以β-actin為內(nèi)參，行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的GAS5表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1b），表明AsPC-1細(xì)胞系成功構(gòu)建，pcDNA3-GAS5過(guò)表達(dá)。

圖 1 GFP轉(zhuǎn)染及PCR檢測(cè)（a.GFP轉(zhuǎn)染AsPC-1，上圖為顯微鏡明場(chǎng)下拍照，下圖為顯微鏡熒光下拍照，顯微鏡倍數(shù)100倍；b.GAS5相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)）

2.2 轉(zhuǎn)染GAS5對(duì)AsPC-1細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞，使用Annexin V-FITC／PI凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行凋亡檢測(cè)。結(jié)果顯示，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組早期凋亡率分別為（5.1%±2.1%）和（4.8%±2.1%），兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組晚期凋亡率分別為（6.5%±1.8%）和（6.7%±3.0%），兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖 2 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞流式圖凋亡水平［橫坐標(biāo)為FITC，縱坐標(biāo)為PE；Q1象限：（AnnexinV-FITC）-／PI+為壞死細(xì)胞，Q2象限：（AnnexinV+FITC）+／PI+為晚期凋亡細(xì)胞，Q3象限：（AnnexinV-FITC）-／PI-為活細(xì)胞，Q4象限：（AnnexinV-FITC）+／PI-為早期凋亡細(xì)胞］

2.3 轉(zhuǎn)染GAS5對(duì)AsPC-1細(xì)胞遷移能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)照組24 h的相對(duì)劃痕面積愈合率為（77.9%±0.5%），高于實(shí)驗(yàn)組的（67.7%±0.4%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組48 h的相對(duì)劃痕面積愈合率為（89.8%±0.6%），高于實(shí)驗(yàn)組的（77.5%±1.1%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GAS5可抑制細(xì)胞的遷移能力。見(jiàn)圖3。圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GAS5對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞遷移能力的影響（a.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力；b.對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相對(duì)劃痕面積愈合百分率）

2.4 轉(zhuǎn)染GAS5對(duì)AsPC-1細(xì)胞侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細(xì)胞進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為（535±28），高于實(shí)驗(yàn)組的（314±21），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組可明顯抑制細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖4。

圖 4 GAS5對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞侵襲能力的影響（a.Transwell檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞侵襲能力，0.4%結(jié)晶紫染色，顯微鏡倍數(shù)100倍；b.對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲數(shù)）

3 討論

胰腺癌惡性程度高，現(xiàn)有的治療手段均不能顯著延長(zhǎng)患者生存期。總體來(lái)說(shuō)，胰腺癌仍缺乏有效的治療靶點(diǎn)。因此，積極探索胰腺癌新的有效治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。隨著分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者們開(kāi)始關(guān)注到lncRNA和胰腺癌的關(guān)系。lncRNA本身不編碼蛋白或只編碼很短的多肽，近年來(lái)的研究表明，其能夠在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)、基因表達(dá)、生長(zhǎng)、分化方面發(fā)揮重要作用［10］。此外，還可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控等方式影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、耐藥與轉(zhuǎn)移等多個(gè)特征性生物學(xué)過(guò)程［11］。

lncRNA5（GAS5）是近期發(fā)現(xiàn)的一種生長(zhǎng)停滯特異轉(zhuǎn)錄本，其在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，多數(shù)研究認(rèn)為，GAS5可以抑制人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9，11-12］。但是，GAS5對(duì)胰腺癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響尚未完全清楚。Gao 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，GAS5能夠通過(guò)miR-181c-5pt調(diào)控Hippo通路，影響胰腺癌對(duì)化療藥物的耐藥性。Lu等［14］研究表明，GAS5還可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶6的表達(dá)水平在一定程度上抑制胰腺癌細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步研究GAS5對(duì)胰腺癌腫瘤細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)功能的作用與影響，本研究將GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌AsPc-1細(xì)胞株，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果示，GAS5轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡無(wú)顯著影響。而Gao等［15］的另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，GAS5可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。筆者推測(cè)這與本研究選擇的細(xì)胞系不同有關(guān)。Gao等［15］選擇的細(xì)胞系為PANC-1、BxPC-3等，其惡性表型與AsPC-1細(xì)胞不同。另外，也可能與凋亡檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)不同有關(guān)。后續(xù)筆者擬通過(guò)增加納入研究的胰腺癌細(xì)胞系種類對(duì)GAS5轉(zhuǎn)染后胰腺癌細(xì)胞凋亡的變化情況進(jìn)行進(jìn)一步研究，以明確GAS5對(duì)胰腺癌腫瘤細(xì)胞生存的影響。本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染GAS5對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力抑制明顯。該結(jié)果與Liu等［16］報(bào)道的體內(nèi)過(guò)表達(dá)GAS5可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力的結(jié)果相類似。這提示GAS5在不同類型腫瘤中可能存在相似的調(diào)控作用，需要進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

綜上所述，lncRNA GAS5對(duì)胰腺癌AsPc-1細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響，對(duì)其遷移、侵襲能力有明顯的抑制作用，這可能為胰腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)。