丹參麥味顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王 婷，江歡歡，劉恩荔，房嘉程，張思蔚，扈明玉，喬麗俊，鄭曉俊

心悸怔忡是指病人自覺心中悸動、驚悸不安，甚則難以自持，患病率逐年增加，反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重者危及生命。丹參麥味顆粒由丹參、麥冬、酒女貞子、制何首烏等20余種藥味組成，是醫(yī)院應(yīng)用傳統(tǒng)工藝配制的中藥制劑，經(jīng)多年臨床應(yīng)用，治療心悸怔忡療效顯著，具有良好的開發(fā)與應(yīng)用前景，尚未建立科學(xué)有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。本研究采用薄層色譜法(TLC)對方中丹參、赤芍、佛手、蘆根、當(dāng)歸、川芎、酒女貞子、制何首烏進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)對君藥丹參中含量高且活性顯著的指標(biāo)成分丹酚酸B進(jìn)行含量測定[3-5]，以期建立科學(xué)、規(guī)范的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 F-020S超聲清洗機(深圳福洋科技集團有限公司)；JA5003電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HH-2數(shù)顯水浴鍋(常州國華)；ZF-20D型暗箱三用紫外分析儀(驥輝)；KDM型可調(diào)控溫電熱套(山東華魯)；Waters 2695高效液相色譜儀(美國沃特世科技有限公司)；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；硅膠G薄層板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)。

1.2 實驗藥物 丹參麥味顆粒由晉中市中醫(yī)院藥劑科制備；丹酚酸B對照品(批號：121521-90-2，含量測定用)、佛手對照藥材(AF20100116)、川芎對照藥材(AF20112904)、當(dāng)歸對照藥材(AF20100109)、麥冬對照藥材(AF20100112)、芍藥苷(AF20070752)、蘆根對照藥材(AF20100115)、大黃素(AF20021321)，購自成都埃法生物科技有限公司；丹參對照藥材(120923-200610)、制何首烏對照藥材(121454-201405)、酒女貞子對照藥材(121041-201404)，均購自中國食品藥品檢定研究院。水為怡寶牌飲用純凈水；甲醇、乙腈(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)均為色譜純，其余試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 薄層鑒別

1.3.1.1 丹參 取本品適量，研成細(xì)粉，稱取10 g，置于錐形瓶中，加入25 mL水溶解，再置入分液漏斗中加入乙酸乙酯，萃取2次，每次15 mL，合并有機相，旋蒸，蒸干后加甲醇1 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。取丹參對照藥材1 g，按上述方法制成對照藥材溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去丹參陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取15 μL、對照藥材溶液取10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以甲苯-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(4∶6∶8∶1∶6)為展開劑，展至距薄層板上沿1 cm處，取出，至室溫下陰干，噴以2% FeCl3·CH3CH2OH溶液，置入干燥箱中，設(shè)置溫度為105 ℃，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，與藥材對照色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1A。

1.3.1.2 赤芍 稱取本品粉末10 g，置具塞錐形瓶中，加入乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙醇1 mL溶解，得到供試品溶液。取芍藥苷對照品，按上述方法配制成濃度為1 mg/mL的對照品溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去赤芍的陰性樣品，按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取15 μL、對照品溶液取5 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶2∶0.3)為展開劑，展至距薄層板上沿1 cm處，取出，至室溫下陰干，均勻噴以5%香草醛硫酸溶液，置入干燥箱中，設(shè)置溫度為105 ℃，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，與對照品色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1B。

1.3.1.3 佛手 稱取本品粉末10 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL使粉末溶解，再加入正丁醇30 mL，超聲處理30 min，移至分液漏斗中，靜置分層，棄去水液，將正丁醇液旋蒸，蒸干后加甲醇2 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。取佛手對照藥材0.5 g，按上述方法制得對照藥材溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去佛手的陰性樣品，同上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取15 μL、對照藥材溶液取10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(6∶2)為展開劑，展至距薄層板上沿1 cm處，取出，置室溫下陰干，紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的藍(lán)色熒光。詳見圖1C。

1.3.1.4 蘆根 稱取本品粉末10 g，置入具塞錐形瓶中，加水25 mL使粉末溶解，再加二氯甲烷30 mL，超聲處理30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置分層，棄水液，將二氯甲烷液旋蒸，蒸干后加二氯甲烷2 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。取蘆根對照藥材0.5 g，按上述方法制得對照藥材溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去蘆根的陰性樣品，同上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取15 μL、對照藥材溶液取10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚-甲酸乙酯-甲酸(14∶4∶1)為展開劑，展開至薄層板上沿1 cm處，取出，置室溫下陰干，均勻噴以顯色劑磷鉬酸溶液，置干燥箱中，設(shè)置溫度為105 ℃，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，與對照藥材色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1D。

1.3.1.5 麥冬 稱取本品粉末10 g，置入具塞錐形瓶中，加水25 mL使粉末溶解，再加鹽酸2 mL，置100 mL圓底燒瓶中，水浴加熱回流30 min，放冷后過濾，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入二氯甲烷，萃取兩次，每次25 mL，合并有機相，旋蒸，蒸干后加甲醇1 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。取麥冬對照藥材1 g，按上述方法制得對照藥材溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去麥冬的陰性樣品，同上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液、對照藥材溶液和陰性對照溶液各取5 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮(4∶1)為展開劑，展開至距薄層板上沿1 cm處，取出，置室溫下陰干，紫外燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1E。

1.3.1.6 當(dāng)歸和川芎 稱取本品粉末10 g，置入具塞錐形瓶中，加乙酸乙酯25 mL，超聲處理20 min，濾過，重復(fù)提取1次，合并提取液，旋蒸，蒸干后加乙醇1 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。分別稱取當(dāng)歸、川芎對照藥材各1 g，按上述方法制得對照藥材溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去當(dāng)歸和川芎的陰性樣品，按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取15 μL、當(dāng)歸和川芎對照藥材各取10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚-丙酮(9∶4)為展開劑，展開至距薄層板上沿1 cm處，取出，置室溫下陰干，紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1F。

1.3.1.7 酒女貞子 稱取本品粉末10 g，置入具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，旋蒸，蒸干后加甲醇1 mL溶解殘渣，得到供試品溶液。取酒女貞子對照藥材1 g，按上述方法制得對照藥材溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去酒女貞子的陰性樣品，按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取15 μL、對照藥材溶液取10 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶0.2∶0.2)為展開劑，展開至距薄層板上沿1 cm處，取出，置室溫下陰干，紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，與對照藥材色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1G。

1.3.1.8 制何首烏 稱取本品粉末10 g，置入具塞錐形瓶中，加乙醇30 mL，超聲處理30 min，旋蒸，蒸干后加1 mL乙醇溶解殘渣，得供試品溶液。取何首烏對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。取大黃素對照品適量，同法制成濃度為5 mg/mL的對照品溶液。按丹參麥味顆粒處方藥材比例及制備工藝，制備除去制何首烏的陰性樣品，按上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。供試品溶液和陰性對照溶液各取35 μL、對照品和藥材對照溶液各取5 μL，點于同一塊硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-36%乙酸(4∶1∶1∶0.8)為展開劑，展開至距薄層板上沿1 cm處，取出，置室溫下陰干，紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，與對照品和藥材對照色譜對應(yīng)位置顯示相同顏色的斑點。詳見圖1H。

1.3.1.9 佛手、當(dāng)歸和川芎的“整體鑒別” 按照1.3.1.6步驟中當(dāng)歸和川芎的TLC鑒別方法分別吸取步驟中供試品溶液15 μL，步驟中佛手對照藥材10 μL，1.3.1.6步驟中當(dāng)歸和川芎對照藥材各10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑及檢視條件同1.3.1.6項。供試品色譜中，與佛手、當(dāng)歸和川芎對照藥材對應(yīng)位置顯示相同顏色的熒光斑點。詳見圖1I。

圖1 薄層色譜圖(A為丹參：1～3為供試品，4為對照藥材，5為陰性對照；B為赤芍：1～3為供試品，4為芍藥苷對照品，5為陰性對照；C為佛手：1～3為供試品，4為對照藥材，5為陰性對照；D為蘆根：1～3為供試品，4為對照藥材，5為陰性對照；E為麥冬：1～3為供試品，4為對照藥材，5為陰性對照；F為當(dāng)歸和川芎：1～3為供試品，4為當(dāng)歸對照藥材，5為川芎對照藥材，6為陰性對照；G為酒女貞子：1～3為供試品，4為對照藥材，5為陰性對照；H為制何首烏：1，3為供試品，2為大黃素對照品，4為對照藥材，5為陰性對照；I為佛手、當(dāng)歸和川芎：1為佛手對照藥材，2～3為供試品，4為當(dāng)歸對照藥材，5為川芎對照藥材)

1.3.2 丹酚酸B含量測定

1.3.2.1 色譜條件 色譜柱Shim-pack VP-ODS柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.1%磷酸水(22∶78)；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長286 nm。

1.3.2.2 對照品溶液的制備 取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置入50 mL容量瓶中，加入80%甲醇水溶液使溶解，搖勻并定容，制成濃度為216.0 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液10 mL，加入100 mL容量瓶中，加80%甲醇水溶液，定容并搖勻，即得對照品溶液(濃度21.6 μg/mL)。

1.3.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末4.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇水溶液20 mL，稱定重量，超聲處理(120 W，40 kHz) 40 min，冷卻至室溫，稱定，采用80%甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2.4 陰性對照溶液的制備 取組方中除丹參外的其他全部藥味，根據(jù)丹參麥味顆粒劑的組方比例及制備工藝，制備缺少丹參的陰性對照樣品，按1.3.2.3步驟中供試品溶液的制備方法制備，即得。

1.3.2.5 專屬性實驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果顯示，丹酚酸B對照品溶液、陰性溶液、供試品溶液在丹酚酸B保留時間處，均無其他成分干擾，且色譜峰分離度>1.5。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖(A為丹酚酸B對照品溶液；B為丹參麥味顆粒供試品溶液；C為陰性對照溶液)

1.3.2.6 線性關(guān)系分析 分別精密吸取對照品儲備液1.0 mL、3.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL、7.0 mL，置于25 mL、50 mL、100 mL、100 mL、100 mL、50 mL量瓶中，精密加80%甲醇水溶液，分別制成濃度為8.64 μg/mL、12.96 μg/mL、17.28 μg/mL、21.60 μg/mL、25.92 μg/mL、30.24 μg/mL的對照品溶液，按照1.3.2.1的色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量(x)作為橫坐標(biāo)，峰面積(y)作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=106x-19 835，r2=0.999 3。結(jié)果顯示，丹酚酸B在濃度范圍0.172 8～0.604 8 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。詳見圖3、表1。

圖3 線性回歸圖

表1 線性關(guān)系

1.3.2.7 重復(fù)性實驗 取丹參麥味顆粒(20210303)樣品6份，每份約4.0 g，精密稱定，按照1.3.2.3方法制備供試品溶液，按照1.3.2.1步驟中色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為0.90%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。詳見表2。

表2 重復(fù)性實驗結(jié)果(n=6)

1.3.2.8 精密度實驗 取1.3.2.3步驟中的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄峰面積。結(jié)果顯示，丹酚酸B峰面積的RSD值為1.13%(n=6)，提示儀器精密度良好。詳見表3。

表3 精密度實驗結(jié)果(n=6)

1.3.2.9 穩(wěn)定性實驗 取1.3.2.3步驟中供試品溶液進(jìn)行穩(wěn)定性實驗，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h時進(jìn)樣，記錄譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液中丹酚酸B峰面積的RSD值為1.46%(<5.0%)，表明供試品溶液在配制完成后24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。詳見表4。

表4 對照品溶液穩(wěn)定性

1.3.2.10 加樣回收率實驗 取約2.0 g本品粉末9份，精密稱定，置入具塞錐形瓶中，分為3組，每組3份，分別精密加入1.3.2.6步驟濃度為17.96 μg/mL、21.60 μg/mL、25.92 μg/mL的對照品溶液20.0 mL，分別稱重，密塞，采用超聲處理(120 W，40 kHz)40 min，冷卻至室溫，重新稱定，加入80%甲醇水溶液補足減失重量，濾過，取續(xù)濾液即得低濃度、中濃度、高濃度樣品溶液。分別精密吸取20 μL上述樣品溶液，注入液相色譜儀，測定并計算回收率。

1.3.2.11 樣品測定 取丹參麥味顆粒(20210303，20210304，20210305)樣品，按照1.3.2.3步驟制備供試品溶液，按1.3.2.1步驟色譜條件進(jìn)行測定。

2 結(jié) 果

2.1 加樣回收率實驗結(jié)果 結(jié)果顯示：低濃度、中濃度、高濃度回收率為95.20%～98.61%，RSD值為1.50%。詳見表5。

表5 加樣回收率實驗結(jié)果(n=9)

2.2 丹酚酸B在樣品中的含量測定結(jié)果(見表6)

表6 丹酚酸B在樣品中的含量測定結(jié)果(n=3)

3 討 論

3.1 TLC鑒別藥味的選擇 該制劑方中丹參具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用；麥冬具有抗心肌損傷、心律失常、血栓及改善微循環(huán)等作用[6-8]，二者作為君藥，首選列入薄層鑒別項；酒女貞子具有強心、抗動脈粥樣硬化等作用[9]；佛手具有降血壓的作用[10-11]；當(dāng)歸具有改善心肌組織病理損傷及增強心血管功能等作用[12-13]；川芎在心血管疾病中有顯著的臨床療效[14]；赤芍治療動脈粥樣硬化和心肌損傷[15]；制何首烏具有降血脂等作用[16]；蘆根具有保肝、抗氧化、改善脂代謝等作用[17-18]。因此，選用這9味藥進(jìn)行TLC定性鑒別。

3.2 中藥復(fù)方TLC整體鑒別方法初探 本研究按照傳統(tǒng)的TLC鑒別方法，分別根據(jù)各藥味所含指標(biāo)成分的特性，選擇特定的提取溶劑，采用單獨的層析條件和顯色方法，在同一塊薄層板上僅鑒別1味藥味。這種方法能充分滿足復(fù)方制劑定性鑒別，但存在鑒別次數(shù)多，耗時長，效率低等不足。本研究在傳統(tǒng)鑒別方法基礎(chǔ)上，借鑒整體鑒別思路[19]，分析佛手、當(dāng)歸和川芎3種藥在同一薄層色譜條件下的分離效果，建立了同時鑒別3種藥的TLC鑒別方法。

3.3 含量測定指標(biāo)成分及色譜條件的確定 選用合適的指標(biāo)性成分是含量測定的關(guān)鍵因素之一[20]。丹參的有效成分主要為二萜醌類成分(脂溶性)和酚酸類成分(水溶性)，其中丹參酮ⅡA與丹酚酸B在丹參中含量較高且藥理活性突出[21-22]?！吨袊幍洹分械⑺幉暮繙y定以丹參酮ⅡA與丹酚酸B為指標(biāo)。因該制劑采用傳統(tǒng)水煎煮工藝制備而成，丹參酮ⅡA水溶性差，轉(zhuǎn)移率低，故本研究選擇水溶性成分丹酚酸B作為含量測定指標(biāo)成分。丹參水溶性成分含量測定多以乙腈或者甲醇作為有機相，以乙酸溶液或磷酸溶液作為非有機相，柱溫集中在20～40 ℃，波長范圍200～290 nm，為探求最佳色譜條件乙腈-0.1%磷酸溶液(22∶78)，分離度符合要求[23-30]。

綜上所述，通過制定丹參麥味顆粒TLC鑒別方法和HPLC含量測定方法，建立了丹參麥味顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，該方法簡便、可靠、專屬性強、穩(wěn)定性好，可用于制劑的質(zhì)量控制。