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    GM1對高膽紅素血癥腦損傷新生大鼠血清S100B蛋白水平的影響

    2022-07-07 03:52:18陰懷清趙小靜武師潤
    關(guān)鍵詞:腦損傷膽紅素海馬

    宋 瑞,陰懷清,趙小靜,武師潤

    高膽紅素血癥是新生兒科常見的疾病,也是新生兒住院的主要原因之一[1],該病主要是由于膽紅素生成過多,肝對膽紅素?cái)z取和結(jié)合能力降低,腸肝循環(huán)增加等多種原因?qū)е卵逦唇Y(jié)合膽紅素升高,患兒出現(xiàn)皮膚黏膜及鞏膜黃染。未結(jié)合膽紅素透過血腦屏障,在腦組織特定的神經(jīng)核團(tuán)中沉積,若不及時有效地干預(yù),隨著病情進(jìn)展,可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不可逆損傷,甚至導(dǎo)致死亡[2-4]。本研究通過建立7 d齡SD大鼠膽紅素腦損傷模型,給予外源性單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)干預(yù),通過檢測血清S100鈣結(jié)合蛋白B(S100B)蛋白水平,觀察GM1對高膽紅素血癥腦損傷的保護(hù)機(jī)制,為臨床診療提供思路。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 7 d齡SD大鼠120只,清潔級,生產(chǎn)許可證號SCXK(晉)2019-0004,購自山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,體質(zhì)量12~18 g,雌雄不限。隨機(jī)分為3組:對照組(腹腔注射生理鹽水)、高膽紅素血癥組(A組,腹腔注射膽紅素150 mg/kg)和GM1干預(yù)組(B組,腹腔注射膽紅素150 mg/kg+GM1 10 mg/kg)。將每組分為5個亞組,每組8只,分別于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h處死。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 膽紅素購自美國Sigma公司;大鼠S100B酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒-POD(50T)購自博士德生物技術(shù)公司;單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液[2 mL(20 mg)],批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20046213,齊魯制藥公司生產(chǎn);5%水合氯醛由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院兒科提供;甲醛、雙蒸水、3%H2O2溶液、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、二甲苯、二氨基聯(lián)苯胺法(DAB)顯色試劑、蘇木素等試劑由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院病理科提供。

    1.3 膽紅素配制 黑暗環(huán)境下精確稱取膽紅素50 mg,溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH溶液中,加入雙蒸水9 mL,使用濃度0.5 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值為8.5,濃度為85.5 μmol/L,避光保存,并于1 h內(nèi)使用。

    1.4 動物模型制作 A組、B組大鼠腹腔注射膽紅素150 mg/kg,對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水;造模后,B組腹腔注射GM1 10 mg/kg,連續(xù)3 d,每日1次,對照組和A組注射等量的生理鹽水。給藥后,各組大鼠均返回原生長環(huán)境下母乳喂養(yǎng)。

    1.5 觀察指標(biāo)

    1.5.1 行為學(xué)變化 觀察各組大鼠皮膚黃染情況、對外界刺激的反應(yīng)、活動力有無減弱等。

    1.5.2 血清S100B蛋白水平測定 于相應(yīng)時間點(diǎn)抓取大鼠,以5%水合氯醛麻醉,劑量為0.03 mL/10 g,待大鼠進(jìn)入深昏迷狀態(tài)后,使用膠帶固定,打開大鼠胸腔、腹腔,充分暴露心臟,在心室舒張末期,迅速用1 mL注射器刺入左心室,抽取0.5 mL血液置于干燥EP管中,靜置30 min,高速離心機(jī)離心,吸取上層血清,采用ELISA法測定血清S100B蛋白水平。

    1.5.3 病理學(xué)改變 使用生理鹽水充分灌洗,當(dāng)觀察到血性液體變清亮?xí)r停止,再使用20 mL甲醛進(jìn)行灌流,結(jié)束后立即取腦組織,浸泡于甲醛中固定24 h,將固定好的腦組織于視交叉后約5 mm處進(jìn)行冠狀切割,海馬區(qū)包含在所取組織中,梯度乙醇脫水后包埋。將包埋好的石蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片。①行蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變;②TUNEL法測定細(xì)胞凋亡,光鏡下觀察到細(xì)胞核呈棕黃色,即為凋亡細(xì)胞。

    1.5.4 圖像處理 應(yīng)用Scanscope CS數(shù)字病理掃描系統(tǒng)(美國Aperio公司)進(jìn)行圖像采集。掃描所取腦組織病理切片,每張切片中截取海馬區(qū)5個非重疊視野(×400)。記錄各視野凋亡細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞總數(shù),凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100%。

    2 結(jié) 果

    2.1 3組大鼠行為學(xué)變化 整個實(shí)驗(yàn)過程中,無大鼠發(fā)生死亡,實(shí)驗(yàn)開始前,所有大鼠活動均無異常。對照組大鼠全程皮膚、黏膜紅潤,行為活動無異常;A組、B組大鼠造模后約6 h開始出現(xiàn)煩躁、尖叫、抽搐等異常變化,且隨著時間推移,皮膚黃染程度逐漸加重,對外界刺激反應(yīng)越來越差,活動力減弱;A組較B組表現(xiàn)更明顯。

    2.2 3組大鼠不同時間血清S100B蛋白水平比較 A組血清S100B蛋白水平較對照組、B組升高,且與時間呈正相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B組較A組降低,仍高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖1。

    表1 3組大鼠不同時間血清S100B蛋白水平比較(±s) 單位:pg/mL

    圖1 3組不同時間血清S100B蛋白水平折線圖

    2.3 病理學(xué)變化

    2.3.1 海馬區(qū)HE染色改變 對照組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞胞清晰可見,各細(xì)胞形態(tài)正常且排列規(guī)整;A組、B組海馬區(qū)細(xì)胞水腫變性,排列紊亂,大量空泡形成,胞核固縮、溶解、碎裂消失,部分膠質(zhì)細(xì)胞增生;同一時間點(diǎn)相比,鏡下可見B組受損程度較A組減輕。詳見圖2。

    圖2 3組大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色圖(×400)

    2.3.2 海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況 對照組各時間點(diǎn)均無或僅有極少數(shù)細(xì)胞發(fā)生凋亡,A組、B組大鼠于造模后約6 h開始出現(xiàn)凋亡細(xì)胞,24~48 h凋亡細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加,72 h達(dá)到峰值,同一時間比較,B組凋亡細(xì)胞數(shù)目較A組減少,且高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

    表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(±s) 單位:%

    圖3 3組大鼠不同時間腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(×400)

    3 討 論

    國內(nèi)外有多種模擬高膽紅素血癥腦損傷的方法,如經(jīng)靜脈[5]或經(jīng)小腦延髓池注入[6]膽紅素、皮下或腹腔注射鹽酸苯肼[7]、使用基因缺陷Gunn大鼠[8]等。本研究采用陳舜年等[9]腹腔注射膽紅素的方法,注射劑量為150 mg/kg,分析原因:選用腹腔注射膽紅素,重復(fù)性好、簡單經(jīng)濟(jì)、容易操作,成功率高。一項(xiàng)關(guān)于建立膽紅素腦損傷模型的研究顯示,觀察造模后各組大鼠行為學(xué)及病理學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)腹腔注射膽紅素劑量50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg、200 mg/kg均可成功復(fù)制新生兒高膽紅素血癥模型,通過測定腦組織及血清S100B蛋白含量發(fā)現(xiàn),若進(jìn)行膠質(zhì)細(xì)胞損傷方面的研究,注射膽紅素劑量為150 mg/kg更合適[10]。

    GM1在臨床上廣泛用于治療各種腦出血、缺血再灌注損傷等,該藥較安全,半數(shù)致死量(LD50)是872 mg/kg(靜脈注射大鼠)至>8 g/kg(s.c.小鼠),各種動物(大鼠、小鼠、Beagle犬及兔)進(jìn)行亞急性和慢性毒性試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)、生殖毒性試驗(yàn)、圍生期毒性試驗(yàn)及誘變性試驗(yàn)均未顯示其任何毒性作用。相關(guān)研究顯示,動物實(shí)驗(yàn)選用低劑量GM1即可發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用[11-14]。本研究選擇GM1劑量為10 mg/kg,與新生兒常用劑量每日20 mg(8 mg/kg)相近。

    膽紅素腦病是新生兒高膽紅素血癥嚴(yán)重的并發(fā)癥,若不及時發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行早期干預(yù),可能遺留錐體外系運(yùn)動障礙、聽覺異常、眼球向上運(yùn)動受限、牙釉質(zhì)發(fā)育不良等后遺癥,給社會及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[15]。臨床診斷膽紅素腦病主要依靠新生兒行為神經(jīng)測評(Neonatal Behavioral Neurological Assessment,NBNA)、頭顱磁共振(MRI)、腦干聽覺誘發(fā)電位檢查等,這些檢查反映腦損傷情況滯后,臨床早期診斷具有一定的局限性。新生兒膽紅素腦病進(jìn)展快,早期臨床表現(xiàn)有精神萎靡、反應(yīng)低下、嗜睡、拒乳等癥狀不典型,易被忽視,單純依靠影像學(xué)檢查易延誤治療,具有較高的致殘率和致死率。有研究表明,S100B蛋白作為早期預(yù)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的生化指標(biāo)[16],是一種鈣離子結(jié)合蛋白,主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞中,在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)含量最多。多項(xiàng)研究顯示,正常生理狀態(tài)下,S100B蛋白存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),血清含量較少,當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時,激活星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的S100B蛋白,使其在腦脊液中含量增加;同時S100B蛋白可透過損傷的血腦屏障進(jìn)入血液循環(huán),使其在血清水平升高[17-18]。有研究表明,膽紅素腦損傷與血清S100B變化存在相關(guān)性,且隨著膽紅素腦損傷程度加重,血清S100B蛋白水平逐漸增高[19]。一項(xiàng)前瞻性研究顯示,發(fā)生腦損傷時,短時間內(nèi)血清S100B蛋白水平升高,達(dá)到峰值,并持續(xù)2 d[20]。本研究結(jié)果顯示,A組和B組大鼠血清S100B蛋白水平6 h開始升高,24~48 h增長迅速,72 h達(dá)到峰值。有研究顯示,S100B可預(yù)測新生兒腦損傷嚴(yán)重程度,靈敏度和特異度分別為100.0%、93.9%[21]。S100B蛋白在診斷和預(yù)測腦損傷嚴(yán)重程度方面有較高的靈敏度和特異度,臨床應(yīng)用廣泛,在動靜脈血液、腦脊液、尿液、唾液中均能檢測到,且具有易取樣、性質(zhì)穩(wěn)定、不受溶血等優(yōu)點(diǎn)[22]。因此,S100B蛋白可作為早期診斷膽紅素腦損傷的生化標(biāo)志物。

    膽紅素是一種內(nèi)源性的抗氧化劑,在生理狀態(tài)下,可有效清除脂質(zhì)過氧化物、氧自由基,具有一定的保護(hù)作用[23]。過量的膽紅素,尤其是親脂性的未結(jié)合膽紅素可透過血腦屏障,沉積于腦組織中,引起能量代謝異常,誘發(fā)興奮性氨基酸持續(xù)升高,鈣離子超載,導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞水腫變性[24]。過量的游離膽紅素通過刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,減少髓鞘對腦組織造成毒性破壞,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)一系列異常行為表現(xiàn)[25]。神經(jīng)節(jié)苷脂廣泛存在于脊椎動物組織中,患泰薩氏幼年型黑白癡病(Tay-sachs病)的小兒腦中發(fā)現(xiàn),腦白質(zhì)含量很多,GM1通過選擇性阻止興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)異常釋放和重?cái)z取,扭轉(zhuǎn)酪氨酸羥化酶抑制脂質(zhì)過氧化物作用及抑制腦細(xì)胞自噬等多種方式保護(hù)受損的腦組織[26-28]。GM1是可通過血腦屏障的神經(jīng)節(jié)苷脂,通過血腦屏障嵌入細(xì)胞膜,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶等相關(guān)生物酶活性,從而降低細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,調(diào)節(jié)Ca2+、K+水平,減輕腦組織水腫[29-30],對損傷神經(jīng)元的修復(fù)、再生發(fā)揮重要的保護(hù)作用。有研究顯示,GM1通過促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞糖酵解發(fā)揮作用,從而導(dǎo)致這些細(xì)胞攝取葡萄糖和釋放乳酸,存在星形膠質(zhì)細(xì)胞時培養(yǎng)神經(jīng)元,GM1可增強(qiáng)線粒體活性并觸發(fā)神經(jīng)保護(hù)基因表達(dá)[31]。本研究結(jié)果顯示,造模后A組、B組細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)凋亡細(xì)胞,且與時間呈正相關(guān),同一時間比較,B組細(xì)胞凋亡數(shù)目較A組減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明隨著膽紅素進(jìn)入腦組織時間延長,細(xì)胞凋亡數(shù)目和凋亡程度逐漸增加;同時觀察到GM1可減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫變性,減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,對受損腦組織起到一定的保護(hù)作用,具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

    綜上所述,S100B蛋白作為早期診斷新生兒高膽紅素血癥腦損傷的生化標(biāo)志物之一,GM1可減輕膽紅素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用,以期為臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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